VEGF轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促血管新生改善糖尿病下肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病外周血管病變(diabetic peripheral artery disease，PAD)是糖尿病(diabetic mellitus，DM)嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，與非DM患者相比，其主要病理改變?yōu)閯?dòng)脈粥樣硬化，且多累及下肢遠(yuǎn)端動(dòng)脈，病變范圍更廣、呈多節(jié)段彌漫性的狹窄或閉塞，是導(dǎo)致DM足部壞疽、截肢的主要原因，嚴(yán)重影響DM患者的生存質(zhì)量。目前傳統(tǒng)內(nèi)科藥物、介入和手術(shù)治療等對(duì)遠(yuǎn)端血管閉塞、流出道差的DM患者效果不佳，不能從根本上解

2、決問(wèn)題，并且此類DM患者多數(shù)高齡體弱，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，合并多種心腦血管病變，病情復(fù)雜，因此臨床治療上相當(dāng)棘手，迫切需要尋求新的技術(shù)手段，如何促進(jìn)血管新生實(shí)現(xiàn)血運(yùn)重建成為治療關(guān)鍵。
　　近年來(lái)干細(xì)胞移植成為發(fā)展迅速的一種全新治療模式，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)已被證實(shí)是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可以在一定的誘導(dǎo)條件下分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、心肌、血管內(nèi)

3、皮細(xì)胞等，參與不同組織的修復(fù)，但目前仍缺乏移植細(xì)胞在體內(nèi)存活、分化、轉(zhuǎn)歸及參與血管再生的實(shí)驗(yàn)依據(jù)可循，且骨髓MSCs采集風(fēng)險(xiǎn)較大，對(duì)患者年齡、身體條件、心理接受程度要求較高，在實(shí)際應(yīng)用中，由于高糖、氧化應(yīng)激、低氧等微環(huán)境使移植后MSCs的存活率非常低，新生血管形成速度慢等，極大地限制了干細(xì)胞移植治療的效果。相比之下，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUC-MSCs)

4、與BMSCs在生物學(xué)特性方面極為相似，由于其來(lái)源更廣泛，采集方便，擴(kuò)增力可塑性強(qiáng)，無(wú)免疫原性，不存在倫理學(xué)爭(zhēng)議，具有更加有效的MSCs潛能，有可能成為BMSCs的理想替代物，成為目前誘導(dǎo)分化最佳的種子細(xì)胞。
　　對(duì)血循環(huán)的重建而言，目前已知有多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子參與促進(jìn)血管生成作用，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)通過(guò)與其血管內(nèi)皮特異性受體結(jié)合，可顯著促進(jìn)內(nèi)皮

5、增生及血管生成作用，被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子，但直接應(yīng)用VEGF治療存在很多不足，如半衰期短、提純較為困難、應(yīng)用量大、成本昂貴等，限制其臨床應(yīng)用。
　　因此，如何提高M(jìn)SCs在缺血組織存活、分化，增加局部組織生長(zhǎng)因子分泌量，促進(jìn)新生血管形成，提高M(jìn)SCs治療PAD療效是目前亟待解決的主要問(wèn)題。
　　本研究利用基因工程構(gòu)建VEGF-EGFP基因表達(dá)載體，通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染到hUC-MSCs細(xì)胞中，觀察基因轉(zhuǎn)染后對(duì)hUC-

6、MSCs的生長(zhǎng)增殖及目的基因VEGF表達(dá)情況;并利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后hUC-MSCs的活體示蹤定位;同時(shí)建立高脂喂養(yǎng)2型糖尿病SD大鼠下肢缺血模型，將轉(zhuǎn)染后的hUC-MSCs局部肌肉注射，觀察其向血管內(nèi)皮分化促血管新生，側(cè)支循環(huán)的建立，改善下肢缺血的實(shí)驗(yàn)療效;本研究應(yīng)用hUC-MSCs作為VEGF基因治療平臺(tái)，不僅可通過(guò)提高VEGF持續(xù)分泌，達(dá)到

7、局部穩(wěn)定的治療濃度，并通過(guò)VEGF的抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、促進(jìn)血管生成等作用改善缺血后微環(huán)境，為hUC-MSCs增殖、分化等過(guò)程提供最佳的生存空間;同時(shí)可放大hUC-MSCs的旁分泌作用，減少hUC-MSCs凋亡，提高h(yuǎn)UC-MSCs移植后的定位歸巢和存活率等，有效發(fā)揮VEGF與hUC-MSCs在血管再生功效方面的協(xié)同倍增作用，從而為更好的發(fā)揮hUC-MSCs移植療效提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究分為三部分:
　　第一部分腺病毒介導(dǎo)VE

8、GF轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討腺病毒載體介導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)染hUC-MSCs的可行性，以及VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)hUC-MSCs形態(tài)及功能的影響。
　　方法:構(gòu)建VEGF-EGFP重組基因腺病毒載體，分離和培養(yǎng)hUC-MSCs，分為VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組、EGFP空載組及對(duì)照組，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，確定最佳病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection，

9、MOI);依據(jù)最佳MOI值轉(zhuǎn)染并收集細(xì)胞，應(yīng)用蛋白印跡法(Western blot)、RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后目的基因VEGF的蛋白及mRNA表達(dá)情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF蛋白水平，MTT法及流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)染對(duì)hUC-MSCs增殖和細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果:熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示腺病毒介導(dǎo)的VEGF-EGFP基因能夠成功轉(zhuǎn)染hUC-MSCs，且轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)無(wú)影響;目的基

10、因VEGF在細(xì)胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并能分泌到細(xì)胞外，轉(zhuǎn)染后24h采用ELISA法在細(xì)胞培養(yǎng)上清中就檢測(cè)到有VEGF的表達(dá)和分泌，96h仍穩(wěn)定表達(dá);與對(duì)照組和EGFP空載組相比，通過(guò)Western blot、RT-PCR檢測(cè)VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組VEGF表達(dá)水平升高顯著，且表達(dá)穩(wěn)定，可提高h(yuǎn)UC-MSCs的抗凋亡及存活能力;MTT及流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果顯示VEGF基因轉(zhuǎn)染可提高h(yuǎn)UC-MSCs增殖和分化能力。
　　結(jié)論:腺病毒介導(dǎo)V

11、EGF基因能夠成功轉(zhuǎn)染hUC-MSCs，能持續(xù)穩(wěn)定、高效表達(dá)VEGF，改善生存微循環(huán)，提高h(yuǎn)UC-MSCs的增殖及分化、存活能力，為開(kāi)展VEGF基因轉(zhuǎn)染hUC-MSCs移植治療改善糖尿病下肢血管病變的可行性提供理論依據(jù)。
　　第二部分高脂喂養(yǎng)2型糖尿病大鼠下肢缺血模型建立
　　目的:目前普遍采用大鼠后肢股動(dòng)脈結(jié)扎離斷的方法來(lái)制備后肢急性缺血模型，但對(duì)于如何建立及評(píng)估糖尿病高脂高血糖慢性動(dòng)脈硬化閉塞癥的缺血狀態(tài)，尚無(wú)一個(gè)穩(wěn)定有

12、效慢性缺血模型及方法。
　　方法:將大鼠20只隨機(jī)分為2組，DM組10只予以高脂喂養(yǎng)6個(gè)月，腹腔注射（Streptozocin，STZ）(35mg/kg)誘發(fā)糖尿病模型，對(duì)照組(10只)予以普食喂養(yǎng)6個(gè)月，成模DM組及對(duì)照組大鼠在麻醉后，消毒鋪巾，沿右下肢正中的皮膚縱行切開(kāi)，于腹股溝下分離出股動(dòng)脈，在腹股溝韌帶下切斷股動(dòng)脈，近端結(jié)扎，隨后向遠(yuǎn)端銳性剝離直至膝關(guān)節(jié)，分離和結(jié)扎股動(dòng)脈的所有分支，造成右下肢缺血模型，術(shù)后3d、7d、14

13、d、28d觀察大鼠患肢活動(dòng)狀況、肢體顏色、皮溫等，并于術(shù)后1d、3d、14d、28d常規(guī)麻醉后，保持溫度、光線相對(duì)恒定下，應(yīng)用PeriScan PIM3激光多普勒（Laser Doppler Perfusion Imaging，LDPI）行下肢血流監(jiān)測(cè)。術(shù)后28d麻醉動(dòng)物后，切開(kāi)后腹膜，于腹主動(dòng)脈留置套管針，肝素鈉抗凝，以2 ml/s的速率注射造影劑約1.5 ml進(jìn)行CT下肢血管造影。每組動(dòng)物在血管造影后處死，分別取其健側(cè)和患側(cè)股四頭肌

14、和腓腸肌行蘇木精-伊紅染色及CD31免疫組織化學(xué)染色、Western blot測(cè)定肌肉組織VEGF含量。
　　結(jié)果:DM組有（8只）對(duì)照組（10只）制備成后肢缺血模型，術(shù)后第1d，兩組大鼠多普勒血流及CT血管造影均呈顯著降低提示缺血造模成功，兩組術(shù)后第7d和14d行激光多普勒提示缺血肢體血流有逐漸恢復(fù)趨勢(shì)，術(shù)后第28d DM組血流恢復(fù)較對(duì)照組顯著遲緩(P＜0.05);CT血管造影:DM組右下肢股動(dòng)脈結(jié)扎處近端僅有少量血管代償性增加

15、，遠(yuǎn)心端仍無(wú)明顯血流;病理組織及免疫組化染色:術(shù)后第28d DM組缺血部位肌肉組織出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管密度患側(cè)低于健側(cè);缺血肌肉組織VEGF較對(duì)照組的蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:長(zhǎng)期高脂喂養(yǎng)糖尿病模型基礎(chǔ)上，制作股動(dòng)脈結(jié)扎離斷的下肢缺血模型，更接近于糖尿病下肢慢性缺血的情況，320排CT血管造影技術(shù)可以更立體直觀評(píng)估缺血狀態(tài)，為進(jìn)一步探討糖尿病下肢缺血病理機(jī)制及干細(xì)胞治療促血管新生等提供了較為

16、理想的動(dòng)物模型及評(píng)估指標(biāo)。
　　第三部分 VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療改善糖尿病大鼠下肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:通過(guò)腺病毒將重構(gòu)的VEGF-EGFP基因轉(zhuǎn)染到hUC-MSCs細(xì)胞中，同時(shí)建立高脂喂養(yǎng)2型糖尿病SD大鼠下肢缺血模型，將轉(zhuǎn)染后hUC-MSCs局部下肢肌肉注射，觀察血管新生，側(cè)支循環(huán)建立，下肢缺血改善的實(shí)驗(yàn)療效。
　　方法:利用高脂飲食STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病SD大鼠下肢股動(dòng)脈結(jié)扎建立缺血模

17、型后，將分組觀察VEGF-EGFP-hUC-MSCs、EGFP-hUC-MSCs、hUC-MSCs及PBS局部肌肉注射到下肢缺血部位，熒光倒置顯微鏡觀察移植細(xì)胞存活及定位;在治療后2、4周，激光多普勒（瑞典Peimed，LDPI）檢測(cè)局部血流;觀察下肢活動(dòng)度和缺血情況;4周后利用腹主動(dòng)脈結(jié)扎行下肢動(dòng)脈CTA(東芝320層CT機(jī))造影檢測(cè)雙下肢血管側(cè)支循環(huán)的形成;肌肉組織HE染色和CD31免疫組化檢測(cè)新生毛細(xì)血管數(shù)量及密度;RT-PCR、

18、Western blot等檢測(cè)組織標(biāo)本中VEGF及MMP2，MMP9，TIMP1，TIMP2，ERK，AKt相關(guān)基因mRNA及蛋白的表達(dá)等。
　　結(jié)果:移植后1、2、4周熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，在下肢缺血部位有移植的EGFP標(biāo)記的hUC-MSCs存活;移植后2、4周LDPI血流圖顯示VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組血流灌注的恢復(fù)水平要明顯高于EGFP空載組,移植4周后CT血管造影顯示VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組有新生側(cè)支循環(huán)，HE及免疫組化染色顯示

19、新生毛細(xì)血管明顯高均于空載組，RT-PCR及Western blot檢測(cè)組織標(biāo)本VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組VEGF、ERK、AKt、MMP2和MMP9mRNA和蛋白水平較其他兩組顯著增高，TIMP1、TIMP2的表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:肌肉注射移植VEGF基因修飾后hUC-MSCs可在下肢缺血組織中定植存活，高效表達(dá)VEGF，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)，比單純hUC-MSCs更能有效地促進(jìn)血管新生，明顯改善糖尿病下肢缺血狀態(tài)，為hUC-MSC