VEGF及SiRNA和AP-2α對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響.pdf

1、第一部分 AP-2α在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)VEGF的表達(dá) 研究背景： 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)的發(fā)生、發(fā)展和演變過程是多種因素綜合致病的病理過程，血管內(nèi)皮在此過程發(fā)揮著很重要的作用，內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是引起As的始動(dòng)環(huán)節(jié)，減少內(nèi)皮損傷和恢復(fù)內(nèi)皮功能在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中的作用已逐步得到重視。鑒別與As疾病相關(guān)的易感基因，發(fā)現(xiàn)新的以及有效的針對(duì)As疾病的治療方案，一直是醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。

2、研究表明，AP-2(activatorprotein-2，AP-2)蛋白通過蛋白-DNA相互作用直接調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vaseular endothelial growth factor，VEGF)，參與了AS疾病的發(fā)生發(fā)展。在HaCaT角化細(xì)胞中，AP-2α可以影響VEGF的表達(dá)。血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)為覆蓋在血管內(nèi)表面的單層扁平細(xì)胞，具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、自分泌、旁分泌等多種功能，通過研究血管內(nèi)皮細(xì)胞來探

3、究血管的生物學(xué)作用極為重要。AP-2α是否在主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)目前未見報(bào)道，由于在VEGF啟動(dòng)子包含有AP-2的結(jié)合位點(diǎn)，本研究將探索AP-2α在血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)VEGF表達(dá)的影響，進(jìn)而研究其參與As形成的相關(guān)機(jī)制。 方法： 1.頸椎脫臼處死C57BL/6J小鼠(體重20～25g)，無菌條件下徹底清除外膜結(jié)締組織，完整取出其胸主動(dòng)脈，植塊法進(jìn)行小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞原代(含20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液

4、)和傳代培養(yǎng)(含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液)。倒置相差顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)特性，Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞。 2.以小鼠腦cDNA文庫(kù)作為模板，以AP-2αFP、AP-2αRP為引物，PCR擴(kuò)增約130.bp的AP-2α全長(zhǎng)編碼序列，然后通過膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體，得到pMD18-T-AP-2α重組表達(dá)載體。其PCR產(chǎn)物擴(kuò)增質(zhì)粒用EcoR I/Xho I酶切并回收AP-2α全長(zhǎng)基因序

5、列，然后與同樣酶切的表達(dá)載體pCMV-Myc連接構(gòu)建表達(dá)載體pCMV-Myc-AP-2α，用EcoR I/Xho I進(jìn)行酶切鑒定。 3.取2～4代細(xì)胞分別以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV-Myc，pCMV-Myc-AP-2α，以及SiRNA-AP-2α，Control-RNAi-AP-2α，然后采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)AP-2α和VEGF mRNA與蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.血管植塊在含有

6、20％FBS的。DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d左右，將血管植塊除去并換液，12 d左右細(xì)胞開始融合成片，倒置顯微鏡下觀察呈鋪路石樣。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞和原代形態(tài)相似，生長(zhǎng)較快，4-5天可以融合成單層。血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的檢測(cè)，顯示：細(xì)胞質(zhì)均呈黃褐色著色，胞核不著色，而陰性對(duì)照用PBS代替一抗，沒有加入抗細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原兔多抗工作液，無特殊顯色。 2.通過連接反應(yīng)將AP-2α片段正確插入載體pCMV-Myc中，酶切電泳分析和測(cè)序

7、證明正確構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Myc-AP-2α。 3.小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞被分別短暫轉(zhuǎn)染AP-2α表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-Myc-AP-2α)和空質(zhì)粒(pCMV-Myc)，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-Ap-2α后，AP-2α的表達(dá)水平顯著上升，干擾AP-2α后，其表達(dá)水平顯著下降，說明系統(tǒng)工作正常。當(dāng)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-AP-2α、pCMV-Myc、AP-2α RNAi和Con

8、trol-RNAi后，分別檢測(cè)VEGF的mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)過表達(dá)AP-2α?xí)r，VEGF mRNA的表達(dá)水平明顯上升，干擾AP-2α后VEGF mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05，差異具有顯著性)。同時(shí)Western blot檢測(cè)也顯示了相似的結(jié)果，即過表達(dá)AP-2α?xí)r，蛋白AP-2α的表達(dá)量增加，干擾AP-2α后，蛋白AP-2α的表達(dá)量降低。當(dāng)過表達(dá)AP-2α?xí)r，可明顯增加VEGF的蛋白表達(dá)水平；而干擾AP-2α后

9、，則可以降低VEGF的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論： 1.通過血管植塊法可以實(shí)現(xiàn)小鼠動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)，完全可用于基礎(chǔ)和臨床科研。 2.正確構(gòu)建pCMV-Myc-AP-2α真核表達(dá)載體，為下一步進(jìn)行VEGF及AP-2α基因的實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)。 3.VEGF為AP-2α的下游基因，AP-2α可以上調(diào)VEGF的表達(dá)。 第二部分 VEGF iRNA及AP-2α對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響 目的

10、：探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及小干擾片段RNA(siRNA)對(duì)不同時(shí)期ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響，同時(shí)研究在干擾作用下，不同時(shí)期ApoE-/-小鼠體內(nèi)主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中VEGF和AP-2α量的變化及相互作用。 方法： 1.首先在GeneBank上檢索C57BL/6J小鼠VEGFA siRNA序列(NM_009505)，由公司設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成。實(shí)驗(yàn)分5組，用LipofectamineTM20

11、00試劑盒將小干擾片段(VEGFA-siRNA1，VEGFA-siRNA2，VEGFA-siRNA3，VEGFA-siRNA4)和對(duì)照序列(NC-VEGFA)短暫轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，利用RT-PCR法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF基因表達(dá)水平，篩選最有效抑制VEGF基因表達(dá)的siRNA。 2.6周齡，16周齡，28周齡雄性ApoE-/-小鼠各20只，均給予高脂高膽固醇喂養(yǎng)4周后，各周齡分成4組，每組5只小鼠，分為：V

12、EGFA-siRNA組；siRNA-Negative組；陰性對(duì)照組；空白對(duì)照組。分別自小鼠尾靜脈隔日注射1mg/kg/d VEGFA-siRNA；1mg/kg/dsiRNA-Negative；0.2ml的生理鹽水；空白對(duì)照組不注射任何藥物。共計(jì)2周，期間繼續(xù)高脂高膽固醇喂養(yǎng)。 3.血脂水平測(cè)定：檢測(cè)各組ApoE-/-小鼠血清總膽固醇(Tc)、甘油三醋(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含

13、量。 4.小鼠主動(dòng)脈斑塊免疫組化染色：根據(jù)EnvisionTM兩步法免疫組化染色試劑盒說明書操作，檢測(cè)VEGFA與AP-2α在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的表達(dá)情況。 5.定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)：每組20只ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇部及胸主動(dòng)脈，每2只混合提取新鮮粥樣斑塊組織RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)VEGFA、AP-2α mRNA表達(dá)水平。 6.免疫印跡技術(shù)(Westemblot)檢測(cè)蛋白表達(dá)：每組20只Apo

14、E-/-小鼠主動(dòng)脈竇部及胸主動(dòng)脈，每3只混合提取新鮮粥樣斑塊組織蛋白，Westemblot檢測(cè)VEGF、AP-2α的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4均抑制小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFA mRNA和蛋白的表達(dá)水平，特別是VEGFA-siRNA4抑制作用最強(qiáng)，VEGFA mRNA和蛋白表達(dá)下降最明顯。VEGFA-siRNA-negative對(duì)小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFA

15、 mRNA和蛋白表達(dá)水平無抑制作用。因此，VEGFA-siRNA4基因沉默效果最好。 2.同組ApoE-/-小鼠血脂含量及體重比較差異無顯著性(P>0.05)。各組間血脂含量及體重比較差異有顯著性(P<0.05)。 3.小鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)均可見AP-2α及VEGF的高表達(dá)。 4.實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot：實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blot顯示：不同周齡組之間，隨著A

16、po E-/-小鼠周齡的增加，粥樣斑塊AP-2α mRNA及AP-2α蛋白和VEGFA mRNA及VEGF蛋白表達(dá)逐漸增加。 VEGFA-SiRNA4干擾效果比較：不同周齡組中VEGFA-SiRNA4.組粥樣斑塊VEGFA mRNA含量和VEGFA蛋白表達(dá)水平最弱，差異具有顯著性(P<0.05)。28周齡組干擾效果最明顯(P<0.01)。但均對(duì)AP-2α mRNA含量及AP-2α蛋白表達(dá)水平無明顯影響，差異無顯著性(P>0.0

17、5)。 結(jié)論： 1.通過RNA干擾技術(shù)，成功篩選針對(duì)小鼠VEGFA基因沉默的特異性siRNA，為動(dòng)物試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2.AP-2α及VEGF均參與了小鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。 3.VEGFA及AP-2α對(duì)斑塊的進(jìn)展有促進(jìn)作用，VEGFA基因沉默顯著抑制ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)展期新生血管的形成，但并不影響AP-2α mRNA及AP-2α蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步說明AP-2α是VEGF上游調(diào)控