血管性血友病分型組合實(shí)驗(yàn)的建立和臨床應(yīng)用.pdf

1、目的：(1)建立表達(dá)重組糖蛋白Iba活性片段(rGPIba H1-V289)細(xì)胞株，并且純化其表達(dá)產(chǎn)物，研究其生物學(xué)功能。 (2)通過(guò)rGPIba表達(dá)產(chǎn)物建立一種新的檢測(cè)VWF:RCO的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法，并探討其在血管性血友病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。 (3)比較VWF在正常人組不同ABO血型個(gè)體間質(zhì)和量的差異。(4)建立一套系統(tǒng)的檢測(cè)VWD的診斷和分型組合實(shí)驗(yàn)方法，為VWD的診斷和分型提供更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

2、 方法： (1)利用脂質(zhì)體將含有編碼GPIba H1-V289 DNA質(zhì)粒pCMV3轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用親和層析法純化重組片段。 (2)以抗GPIba的單克隆抗體2D4-IgG為包被抗體捕獲r GPIba，建立VWF：RCO-ELISA法。同時(shí)對(duì)其敏感性、重復(fù)性作方法學(xué)評(píng)估，并與血小板凝聚法檢測(cè)VWF：RCO進(jìn)行比較。 (3)采用ELISA法檢測(cè)正常人組(不同ABO血型)、VWD組及其它出血性疾病組血漿VWF：

3、Ag、VWF:CB、VWF：RCO、VWF：FVⅢB，采用智能血液凝集儀檢測(cè)RIPA水平，采用非連續(xù)緩沖體系的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行VWF多聚物分析。 結(jié)果： (1)經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清含有高表達(dá)的rGPIba，純化重組片段能抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集功能。 (2)運(yùn)用ELISA法檢測(cè)VWF：RCO，VWD患者組與正常人組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0001)；其它出血性疾病組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

4、差異(P>0.05)，該法測(cè)定的批內(nèi)和批間變異分別為5.4％和9.4％。血小板凝聚法檢測(cè)VWF：RCO其批內(nèi)和批間變異分別為17.8％和18.3％。 (3)O型血個(gè)體其VWF，Ag、VWE:RCO及VWF，CB均低于非O型血，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 (4)采用PLT和APTT作為VWD的篩選試驗(yàn)，VWF、Ag、VWF:CB和VWF：RCO-ELISA為確診試驗(yàn)，RIPA、VWF：FVmB和多聚物分析為分

5、型試驗(yàn)。 結(jié)論：(1)CHO細(xì)胞株能恒定表達(dá)rGPIbaH1-V289，重組片段具有較高的純度、免疫學(xué)活性和生物學(xué)活性。 (2)VWF：RCO-ELISA法操作簡(jiǎn)便，特異性、敏感性和重復(fù)性均較好；通過(guò)VWF：RCO/Ag可以鑒別1型、2型及3型血管性血友病(VWD)患者。 (3)O型血較非O型血個(gè)體有更高的出血傾向，在臨床診斷VWD的過(guò)程中要充分考慮ABO血型系統(tǒng)對(duì)血漿VWF水平的影響。 (4)本研究所建