EB病毒潛伏膜蛋白1轉(zhuǎn)化鼻咽上皮細胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景與目的：EB病毒(EBV)是一種在人類普遍流行的γ-皰疹病毒，與許多人類腫瘤如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中EBV潛伏膜蛋白1(LMPl)被公認為病毒基因組編碼的唯一具有促細胞轉(zhuǎn)化作用的瘤蛋白，在鼻咽癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用。LMP1的羧基末端(aa187～386)是LMP1致瘤作用的主要部位，包括3個活化區(qū)域(CTAR)：即CTARl(194～231aa)、CTAR2(TRADD結(jié)合區(qū)351

2、～386aa)與CTAR3(275～330aa)。研究表明，LMP1能持續(xù)活化NF-kB，AP-1，JAKs/STATs并通過這些分子激活下游信號傳導(dǎo)通路而產(chǎn)生致瘤效應(yīng)。由于蛋白質(zhì)磷酸化是信號傳導(dǎo)通路中最廣泛最重要的翻譯后修飾，而且這些通路中的許多信號分子及其磷酸化狀態(tài)還遠遠沒有闡明。因此，為了全面了解、驗證LMP1介導(dǎo)的信號通路，闡明CTAR1、CTAR2與CTAR3在LMP1促鼻咽上皮細胞轉(zhuǎn)化成瘤中所涉及的信號網(wǎng)絡(luò)分子，本研究擬采用

3、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離和鑒定LMP1轉(zhuǎn)化的鼻咽上皮細胞的差異磷酸化蛋白，為EB病毒在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制提供進一步證據(jù)。 方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將野生型LMP1、2個突變型LMP1(TRADD位點突變和aa232～35 1缺失)的逆病毒載體pLNSX-LMP1 WT、pLNSX-LMP1TRADD與pLNSX-LMP 1△232-351(以pLNSX為對照)分別導(dǎo)入PA317包裝細胞，G418篩選2周后擴大培養(yǎng)，自細胞

4、培養(yǎng)上清獲得后續(xù)實驗所需的感染性逆病毒RV-pLNSX、RV-LMP1WT、RV-LMP1TRADD與RV-LMP1Δ232-351。然后，用濃縮的病毒分別感染人鼻咽上皮細胞NP69，匯合克隆培養(yǎng)，獲得NP69-pLNSX 、 NP69-LMPWT 、 NP69-LMP1 TRADD 與NP69-LMP1Δ232-3514種轉(zhuǎn)化細胞系。觀察和檢測以上轉(zhuǎn)化細胞的形態(tài)、生長曲線、平板克隆、細胞周期等。同時，采用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)結(jié)

5、合Westem Blot方法分析NP69-pLNSx、NP69-LMP1WT、NP69-LMP1TRADD與NP69-LMP1Δ232-351細胞系磷酸化蛋白質(zhì)表達的差異，即在感染24小時后抽提細胞總蛋白，2-DE分別分離NP69-pLNSX、NP69-LMP1WT、NP69-LMP 1TRADD與NP69-LMP 1 Δ232-35 1細胞的總蛋白質(zhì)，每組平行進行兩塊膠電泳，其中一塊作為制備膠，另一塊作為分析膠。制備膠考染顯色，得到了

6、分辨率較高、重復(fù)性較好的NP69-pLNSX、NP69-LMP1WT、NP69-LMP1TRADD與NP69-LMP1Δ232-351細胞總蛋白質(zhì)2-D膠電泳圖譜；分析膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后，與抗酪氨酸磷酸化抗體孵育，進行WestemBlot分析，獲得差異表達酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的反應(yīng)圖譜；將制備膠的電泳圖譜和Westem Blot的反應(yīng)圖譜進行比對分析，在制備膠上找到相應(yīng)的差異酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)點。利用MALDI-TOF-MS

7、對差異酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)進行鑒定，部分差異蛋白質(zhì)應(yīng)用免疫沉淀方法進行驗證。 結(jié)果： (1)NP69-LMP1 WT細胞在培養(yǎng)過程中，逐漸由多角形、鵝卵石樣典型上皮形態(tài)演變成細胞間接觸減少的長梭狀纖維細胞樣形態(tài)，而NP69-LMP1TRADD與NP69-LMP1△232-351細胞呈近乎多角形，比較接近NP69-pLNSX細胞形態(tài)；NP69-LMP1WT細胞的生長速度、S期細胞所占比例比NP69-LMP1TRADD與NP6

8、9-LMP1Δ232-351及載體對照組NP69-pLNSX細胞明顯增加。 (2)在NP69-pLNSX與NP69-LMP1WT細胞比較組鑒定了12種差異表達的磷酸化蛋白質(zhì)(上調(diào)有HSP27、波形蛋白等，下調(diào)有膜聯(lián)蛋白A1、GTP結(jié)合蛋白等)，在NP69-LMP1WT與NP69-LMP1TRADD細胞比較組鑒定了11種差異表達的磷酸化蛋白質(zhì)，在NP69-LMP1WT與NP69-LMP1Δ232-351細胞比較鑒定了10種差異表達

9、的磷酸化蛋白質(zhì)。其中大部分是與細胞結(jié)構(gòu)、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)的蛋白。 (3)在這些差異蛋白質(zhì)中，有10種磷酸化蛋白質(zhì)體現(xiàn)了LMP1羧基端各功能區(qū)的特異性，如HSP27在NP69-LMPlWT與NP69-LMP1TRADD細胞表達增加(與NP69-pLNSX細胞比較)，在NP69-LMP1Δ232-351細胞卻不增加等。 (4)免疫沉淀驗證了4種蛋白在轉(zhuǎn)化細胞蛋白磷酸化表達水平的差異，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。

10、結(jié)論： (1)LMP1可能通過上調(diào)HSP27、波形蛋白、角蛋白等，下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1、GTP結(jié)合蛋白，分子伴侶TCP1等多種蛋白的磷酸化促進NP69細胞轉(zhuǎn)化。 (2)CTAR2可能介導(dǎo)LMP1對波形蛋白，ER-60，HSP70等蛋白磷酸化的上調(diào)和膜聯(lián)蛋白A1，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白，蛋白酶體等蛋白磷酸化的下調(diào)而產(chǎn)生致瘤作用。 (3)CTAR3可能介導(dǎo)LMP1對ER-60，角蛋白8，HSP27等蛋白磷酸化的上調(diào)和磷脂酰