不同途徑移植大鼠BMSCs對大鼠肝硬化治療作用的研究.pdf

1、目的：研究經(jīng)尾靜脈，門靜脈，肝臟局部和脾臟局部四種移植途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，CCl4所致的肝纖維化的大鼠肝功能變化及肝臟組織變化，探索其治療作用及其可能機(jī)制，尋找最侍移植途徑。
　　 方法：
　　 一.以密度梯度離心和貼壁法相結(jié)合的方法，分離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)至第三代，觀察其形態(tài)變化及生長曲線。
　　 二.250-300克健康雌性SD大鼠60只，以四氯化碳和酒精聯(lián)合的綜合方法誘導(dǎo)肝硬化模型，

2、10周后隨機(jī)宰殺三只大鼠，觀察其肝臟大體形態(tài)及組織切片，驗證造模成功后，取其中的50只將其隨機(jī)分為對照組，尾靜脈移植組，門靜脈移植組，肝臟局部移植組和脾臟局部移植組。
　　 三.DAPI標(biāo)記對數(shù)生長期的BMSCs，孵育過夜后，在熒光顯微鏡下420nm波長觀察其形態(tài)和標(biāo)記率，調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml后備用。
　　 四.嚴(yán)格無菌和良好麻醉條件下，將DAPI標(biāo)記的BMSCs以106/只的劑量經(jīng)不同和途徑移植給不同的實驗組，對

3、照組僅做開腹術(shù)。
　　 五.將移植BMSCs后的大鼠繼續(xù)培養(yǎng)，各組大鼠仍然以0.3ml/100g的維持劑量皮下注射40％CCl4植物油溶液，予正常飲食喂養(yǎng)，以避免肝功能自發(fā)性恢復(fù)所產(chǎn)生的偏倚。
　　 六.三周后，處死所有實驗動物，取其靜脈血檢測ALT，TBIL，ALB，取肝臟做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察移植率。
　　 結(jié)果：
　　 一.BMSCs的分離培養(yǎng)和標(biāo)記。通過密度梯度離心和貼壁法相結(jié)合的方法分離得

4、到的BMSCs形態(tài)呈棱形，呈纖維細(xì)胞樣，生長旺盛，原代培養(yǎng)需10天左右，經(jīng)傳代和多次換液后，逐漸去除懸浮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，形態(tài)較均一，傳代培養(yǎng)約需3-4天。經(jīng)DAPI標(biāo)記的BMSCs在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色，標(biāo)記率為97％。
　　 二.肝硬化大鼠模型的制做。造模期間大鼠活動減少，精神萎靡，進(jìn)食減少，但大鼠整體耐受狀態(tài)良好。造模結(jié)束時，大鼠死亡5只，死亡者均為體重較大個體，原因可能是CCl4注射過量。隨機(jī)處死5只大鼠，顯示腹水形成，肝

5、臟表面粗糙。病理切片顯示肝內(nèi)假小葉廣泛形成，假葉內(nèi)可見纖維再分隔現(xiàn)象，同時伴有明顯的肝細(xì)再生結(jié)節(jié)。
　　 三.BMSCs移植后效果觀察。各實驗組肝功能均較對照組有明顯改善(P＜0.05)；肝臟局部移植組較其它實驗組肝功能的改善更為明顯(P＜0.05)；門靜脈移植組，脾臟注射移植組，尾靜脈注射移植各組間肝功能改善無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：通過密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法可獲得較高純度的BMSCs；DA