人工養(yǎng)殖史氏鱘繁殖內(nèi)分泌及生殖調(diào)控的研究.pdf

1、為了完善鱘魚的全人工繁殖，本文對人工養(yǎng)殖史氏鱘繁殖內(nèi)分泌進(jìn)行了一些基礎(chǔ)研究，包括克隆了史氏鱘兩種促性腺激素的β亞基cDNA全長，進(jìn)行了序列同源性比較及基因進(jìn)化分析，研究在不同組織中兩種促性腺激素β亞基的mRNA表達(dá)，并驗(yàn)證了GTHⅠ在腦垂體的轉(zhuǎn)錄情況。選用原核表達(dá)載體pET-22b(+)，構(gòu)建了兩種GTHβ亞基的融合表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了原核表達(dá)重組蛋白的初步研究。從鱘魚腦垂體中純化GTH，并建立了放射免疫測定方法。對人工養(yǎng)殖史氏鱘血清促性

2、腺激素(GTH)、11-酮基睪酮(11-KT)和雌二醇(E2)含量的周年變化及與性腺發(fā)育的相關(guān)性進(jìn)行比較分析。研究不同越冬溫度對史氏鱘血清E2、11-KT、GTH的含量及性腺發(fā)育的影響。用離體灌流方法研究了LHRH-A、DA和MT對史氏鱘腦垂體碎片GTH分泌的影響。系統(tǒng)地研究了人工養(yǎng)殖史氏鱘和俄羅斯鱘性腺發(fā)育狀況，并成功地進(jìn)行了人工催產(chǎn)。對胚胎發(fā)育進(jìn)行了一系列觀察，為完善鱘魚全人工繁殖技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。具體研究結(jié)果如下：

3、 從史氏鱘(Acipenserschrenckii)腦垂體中提取總RNA，利用GeneRacerTM技術(shù)，分別克隆得到促性腺激素Ⅰ(GTHⅠ)和Ⅱ(GTHⅡ)的β亞基cDNA全長。史氏鱘GTHⅠ-β亞基cDNA全長為1088bp，開放閱讀框?yàn)?84bp，編碼128個(gè)氨基酸(Genbank序列登錄號為：AY575920)；GTHⅡ-β亞基eDNA全長為616bp，開放閱讀框?yàn)?08bp，編碼136個(gè)氨基酸(Genbank序列登錄號為：A

4、Y575921)。與其他脊椎動物進(jìn)行了兩種基因的氨基酸序列同源性比較表明：史氏鱘GTHⅠ-β與西伯利亞鱘相似性最高，為99.1％；與硬骨魚類中鱸形目相似性最低，為34.5％。GTHⅡ-β與西伯利亞鱘相似性為98.3％，與其他硬骨魚類除鱸形目外都超過60％，與鳥類的相似性最低，為42.8％。兩個(gè)基因成熟肽構(gòu)建的MP樹顯示：GTHⅠ與FSH的β亞基和GTHⅡ與LH的β亞基構(gòu)成兩個(gè)明顯的聚類。用Mega2軟件計(jì)算了所比對物種間開放讀碼框的核苷

5、酸遺傳距離并構(gòu)建了NJ樹和MP樹，兩個(gè)基因β亞基的NJ系統(tǒng)樹和MP系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，鱘魚與真骨魚類分別聚類，共同形成硬骨魚綱的聚類，與傳統(tǒng)分類學(xué)一致。成熟肽相似性、遺傳距離和系統(tǒng)樹分支長度顯示GTHⅠ-β亞基在真骨魚類進(jìn)化速率顯著快于其他脊椎動物，而LH-β亞基在羊膜動物中進(jìn)化比其他脊椎動物快。暗示這兩種糖蛋白基因的進(jìn)化伴隨物種進(jìn)化而顯示其功能。 PCR結(jié)合Southernblot結(jié)果表明GTHⅠ和GTHⅡβ亞基mRNA有廣泛

6、的組織表達(dá)，在腦區(qū)的表達(dá)量普遍高于外周組織。GTHⅠβ在脊髓中沒有檢測到表達(dá)，在腦垂體表達(dá)量最高；外周組織中精巢表達(dá)量最高。GTHⅡβ在腦區(qū)都有表達(dá)，仍然是垂體表達(dá)量最高。性腺表達(dá)量較其他外周組織高。Northernblot顯示GTHⅠ在腦垂體中有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，大小約為1167bp和855bp。 選用原核表達(dá)載體pET-22b(+)，分別插入史氏鱘GTHⅠ&Ⅱβ亞基成熟肽cDNA序列，構(gòu)建成C端含有6個(gè)組氨酸(6-His)融合蛋白

7、標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒；分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)兩個(gè)基因。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示重組融合蛋白分子量分別為：GtHⅠβ亞基大約14KD，GtHⅡβ亞基15KD左右。分別用抗組胺酸融合標(biāo)簽的單克隆抗體及兔抗鱘魚GTH多克隆抗體對兩個(gè)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western-Blot分析，結(jié)果顯示目的蛋白分子量與預(yù)期的一致，說明重組蛋白有較高的免疫活性。兩個(gè)重組蛋白都是在2小時(shí)就有明顯的表達(dá)，6小時(shí)后隨著時(shí)問增加表達(dá)量不再增加；

8、25℃誘導(dǎo)重組蛋白產(chǎn)量比37℃誘導(dǎo)產(chǎn)量低；GTHⅠβ表達(dá)蛋白在上清和沉淀中都存在，可溶性蛋白比包涵體略少；大多數(shù)GTHⅡβ重組蛋白以包涵體形式存在。 用蛋白質(zhì)快速液相層析(FPLC)分離鱘魚腦垂體GTH，共獲得GTH純化蛋白4.6mg。反相高效液相色譜(rpHPLC)分離出兩個(gè)亞基，質(zhì)譜測定α亞基分子量：15603KD，兩個(gè)β亞基分子量分別為14338KD和14694KD。制備了鱘魚GTH的多克隆抗體，并用125Ⅰ標(biāo)記抗原，建立

9、放射免疫測定方法。測定了催產(chǎn)前后不同時(shí)間史氏鱘血清中GTH含量的變化，統(tǒng)計(jì)分析表明成功排卵的魚比未排卵和陰性對照組在催產(chǎn)后12小時(shí)和16小時(shí)GTH分泌量升高顯著。 通過測定3-4齡和5-6齡史氏鱘11-KT、E2和GTH的周年變化，分析了這幾種性激素的分泌與人工養(yǎng)殖史氏鱘性腺發(fā)育狀況的關(guān)系。3-4齡史氏鱘雄魚血清11-KT的含量隨季節(jié)變化差異顯著，個(gè)體差異較大，最高值達(dá)到240ng/ml(8月)。在6月、8月、10月份含量高于其

10、他月份。5-6齡史氏鱘雄魚周年變化與3-4齡相似，說明在6-10月是精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子生成時(shí)期。 3-4齡史氏鱘雌魚11-KT分泌高峰也是6-10月，含量在0.5ng/ml-10.5ng/ml之間。5-6齡雌魚11-KT含量范圍從0.1ng/ml到200ng/ml以上。在6-10月份顯著高于3-4齡雌魚?？梢婋S著卵黃開始沉積，11-KT含量也迅速升高。建議對于人工養(yǎng)殖史氏鱘不晚于3+齡的魚可以通過測定11-KT含量進(jìn)行雌雄鑒

11、別。 3-4齡史氏鱘E2含量周年個(gè)體差異不大。雌雄魚都在三月份含量最高。5-6齡雌魚從1月份開始到4月份E2含量個(gè)體差異明顯，性腺發(fā)育Ⅱ期的雌魚E2周年變化不明顯。 3-4齡史氏鱘雌雄魚GTH周年變化趨勢相似，都是在12月和3月有兩個(gè)峰值，其中3月份含量最高。5-6齡史氏鱘雌魚GTH范圍是：0.17ng/ml-29ng/ml；雄魚為7.8ng/ml-22ng/ml。性腺發(fā)育為Ⅱ、Ⅳ期的雌魚在3月份含量最高，Ⅲ期雌魚在四月

12、份含量最高。雄魚在3月份GTH含量最高。E2與GTH的周年變化趨勢一致，說明它們的分泌呈正相關(guān)，但與11-KT的分泌高峰時(shí)期互補(bǔ)。 通過測定不同越冬溫度下11-KT、E2和GTH的變化了解越冬溫度對養(yǎng)殖史氏鱘性腺發(fā)育的影響。高溫越冬能夠促進(jìn)卵黃生成作用，性腺發(fā)育成熟的雌魚比正常越冬的雌魚卵細(xì)胞極化快，但也更容易發(fā)生卵泡閉鎖現(xiàn)象。高溫越冬能夠促進(jìn)雄魚精子的發(fā)育，提前成熟，但如果不及時(shí)催產(chǎn)，性腺會很快進(jìn)入退化狀態(tài)。 腦垂體離

13、體灌流實(shí)驗(yàn)證明低劑量LHRH-A隨脈沖式刺激的引入出現(xiàn)GTH釋放的波浪式增加，中、高劑量出現(xiàn)釋放延后現(xiàn)象，表明高劑量LHRH-A對GTH的釋放有“自身抑制作用”。對于性腺發(fā)育沒有成熟的鱘魚，LHRH-A在10nM到1000nM范圍內(nèi)對腦垂體的GTH釋放沒有劑量依存關(guān)系，也許在低于10nM的范圍內(nèi)存在劑量依存關(guān)系。研究證明DA抑制了LHRH-A誘導(dǎo)的腦垂體GTH的釋放，再次證明在高等硬骨魚類中存在的雙重神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)在古老的鱘魚中也存在。

14、持續(xù)引入200nM的MT刺激后從第二個(gè)小時(shí)可以看到實(shí)驗(yàn)組GTH的分泌量高于對照組，基礎(chǔ)分泌百分?jǐn)?shù)能到247％；5小時(shí)后引入的LHRH-A刺激，GTH基礎(chǔ)分泌增加了大約3倍。說明MT對史氏鱘幼魚的腦垂體釋放GTH有正反饋?zhàn)饔谩?對養(yǎng)殖的史氏鱘和俄羅斯鱘進(jìn)行了性腺發(fā)育、人工繁殖和胚胎發(fā)育的研究。在繁殖季節(jié)通過外觀和組織切片對池塘養(yǎng)殖7齡的俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)性腺發(fā)育進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雌性個(gè)體間性腺發(fā)

15、育差異較大(n=500)。有73％在卵巢中可以看到白色卵粒，卵徑小于1.0mm；有16％左右性腺達(dá)到Ⅲ期，卵粒已經(jīng)著色；有9％左右發(fā)育到Ⅳ期早期，卵徑平均為2.6±0.2mm；還有2％性腺組織中的卵粒透明，組織學(xué)觀察屬于Ⅰ期卵巢。雄性俄羅斯鱘全部達(dá)到性成熟，有部分成熟好的可以擠出精液。GTH含量與雌、雄魚性腺發(fā)育狀況有相關(guān)性。成功催產(chǎn)了八齡和九齡的雌性俄羅斯鱘。人工養(yǎng)殖一齡史氏鱘性細(xì)胞已經(jīng)分化，1+齡史氏鱘雌雄魚性腺在外觀已經(jīng)出現(xiàn)差異；