Bcl10基因Knockdown對HCT116細胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、【背景和目的】：惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及一系列復(fù)雜的分子過程。在癌變過程中,伴隨有多種致癌基因的活化或突變以及抑癌基因的失活。Bcl10基因是一種從MALT淋巴瘤t(1;14)(p22;q32)染色體易位斷裂點克隆出的與細胞凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)的基因,由其編碼的Bcl10蛋白廣泛參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。Bcl10基因的突變或過表達與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1,2]。在多種實體瘤如卵巢癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝細胞肝癌、宮頸癌、乳癌、腎透明細胞癌

2、中研究發(fā)現(xiàn),Bcl10廣泛參與癌細胞的侵襲浸潤,促進癌細胞生長[3-8]。研究表明,結(jié)直腸癌組織中Bcl10表達顯著高于正常組織[9],那么Bcl10的高表達是否也參與結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為呢?本文擬通過慢病毒介導(dǎo)的Bcl10基因knockdown后對這一問題進行研究,并探討可能的分子機制。
　　【方法】：利用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法包裝含Bcl10基因shRNA的慢病毒顆粒,并用其感染HCT116細胞,puromycin選擇性篩選,構(gòu)建

3、Bcl10基因穩(wěn)定沉默的細胞株模型。利用RT-PCR和WesternBlot檢測Bcl10mRNA和蛋白表達水平,臺盼藍拒染法和噻唑藍法(MTT)檢測細胞生長情況,克隆形成實驗觀察細胞克隆形成能力。流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞周期改變,體外遷移實驗(Transwell小室)和劃痕實驗分析Bcl10基因knockdown后對HCT116細胞遷移能力的影響,Western Blot和EMSA技術(shù)檢測相關(guān)信號通路分子的改變,探討其可能的分子機制。<

4、br>　　【結(jié)果】：將攜帶Bcl10shRNA的慢病毒顆粒感染HCT116,經(jīng)puromycin篩選成功構(gòu)建陰性對照組細胞HCT116/sh-eGFP、實驗組細胞HCT116/shBcl10。經(jīng)RT-PCR和WesternBlot鑒定后,發(fā)現(xiàn)實驗組Bcl10在基因和蛋白水平都被有效抑制。將該細胞模型用于后續(xù)研究,結(jié)果:(1)臺盼藍拒染法和噻唑藍法(MTT)都表明,HCT116/shBcl10的生長受到明顯抑制(P<0.05)。在克隆形成

5、實驗中也發(fā)現(xiàn)HCT116/shBcl10克隆形成能力下降(P<0.05)。流式細胞術(shù)測細胞周期顯示,HCT116/shBcl10組細胞被阻滯在G2/M期。體外遷移實驗證實,空白組HCT116和陰性對照組HCT116/sh-eGFP穿膜細胞數(shù)沒有明顯差異(P>0.05),但HCT116/shBcl10穿膜細胞數(shù)與空白組和陰性對照組相比,差異有顯著性意義(P<0.05),說明Bcl10基因knockdown后使HCT116細胞的遷移能力顯著

6、降低。(2)應(yīng)用WB和EMSA技術(shù)檢測相關(guān)信號通路分子的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bcl10基因knockdown后,Pin1、MMP-7、MMP-9、Cdc25c、Cdc2P34、cyclinB1等分子的表達受到抑制,p-Cdc2P34(Thr14/Tyr15)的表達上調(diào),而NF-κB和JNK分子未發(fā)生改變。
　　【結(jié)論】：應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了Bcl10基因knockdown的細胞株HCT116/shBcl10。Bcl10