E2F1在斑馬魚初級(jí)造血中的作用.pdf

1、血細(xì)胞發(fā)生（Hematopoiesis）是脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育以及整個(gè)生命活動(dòng)過程中的重要事件。血細(xì)胞發(fā)生的異常將嚴(yán)重影響動(dòng)物的胚胎發(fā)育以及導(dǎo)致多種危重疾病，如：胚胎流產(chǎn)、先天性貧血、白血病等。斑馬魚（Danio rerio）作為模式生物，在研究初級(jí)造血過程中有易得到實(shí)驗(yàn)材料的優(yōu)勢(shì)。E2F1（E2F transcription factor1）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡中都具有重要作用，近期研究表明，E2F1可能在

2、造血信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。在造血信號(hào)通路中作為關(guān)鍵因子影響造血。GATA1、PU.1是造血過程中關(guān)鍵的標(biāo)志性因子可以影響血細(xì)胞發(fā)生。其中，GATA1是一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在初級(jí)紅細(xì)胞生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PU.1是啟動(dòng)髓系細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵因子。本研究以斑馬魚為模型，應(yīng)用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)建立E2F1基因敲除的斑馬魚系，揭示E2F1在魚類造血中的功能，可以加深重要轉(zhuǎn)錄因子E2F1在魚類造血新功能的認(rèn)識(shí)。主要實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

3、
　　1.斑馬魚E2F1基因的克隆和表達(dá)分析
　　本研究對(duì)斑馬魚E2F1基因進(jìn)行了克隆和序列分析，結(jié)果表明E2F1基因的編碼區(qū)序列長度為1302 bp，編碼433個(gè)氨基酸。同源比對(duì)分析表明，斑馬魚E2F1序列與哺乳動(dòng)物小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）相似性均為80％，與人（Homo sapiens）相似性為70%。此外，采用QRT-PCR法檢測(cè)了E2F1基因在斑馬魚1 dpf-5

4、dpf的表達(dá)情況，結(jié)果表明，1 dpf時(shí)E2F1 mRNA表達(dá)量最高，2 dpf開始下降，3 dpf后表達(dá)量顯著下降，并且3 dpf、4 dpf、5 dpf表達(dá)水平差異不明顯（P>0.05）。
　　2.應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建E2F1基因敲除斑馬魚系
　　以克隆得到的實(shí)驗(yàn)室斑馬魚E2F1基因DNA序列全長為基礎(chǔ)，預(yù)測(cè)確定最優(yōu)靶位點(diǎn)為：5’-GGAGGTTTCTGAGCTGACGG-3’。在此基礎(chǔ)上采用CRISP

5、R/Cas9基因敲除技術(shù)，經(jīng)過多代篩選和最終測(cè)序成功獲得兩種 E2F1敲除的純合斑馬魚系，分別為缺失8 bp和4 bp兩個(gè)品系。
　　3. E2F1基因在斑馬魚早期造血中的功能分析
　　為了確定E2F1的敲除效果，本研究采用QRT-PCR法檢測(cè)了E2F1基因敲除的兩個(gè)斑馬魚品系2 dpf時(shí)E2F1 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示E2F1敲除斑馬魚系的E2F1 mRNA表達(dá)量顯著下降。同時(shí)，本研究還檢測(cè)了E2F1敲除后對(duì)下游血細(xì)胞

6、發(fā)生標(biāo)志基因GATA1、PU.1 mRNA表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示E2F1敲除斑馬魚中GATA1和PU.1表達(dá)量也顯著下降。此外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)E2F1敲除后斑馬魚48 hpf胚胎進(jìn)行了O-dianisidine（二鹽酸鄰聯(lián)茴香胺）染色，檢測(cè)成熟紅細(xì)胞的變化，結(jié)果表明 E2F1敲除斑馬魚48 hpf胚胎尾部血管中血細(xì)胞數(shù)量明顯減少。我們還檢測(cè)了E2F1敲降（注射E2F1 morpholino）斑馬魚48 hpf胚胎血細(xì)胞發(fā)生情況，結(jié)果表明，E2