RNA干擾靶向抑制Pin1對大腸癌SW480、SW620細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、大腸癌(Colorectal cancer)是嚴(yán)重威脅人類生存的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在西方國家惡性腫瘤的發(fā)病率中居第二位。我國百姓隨著生活水平提高，飲食習(xí)慣發(fā)生高脂肪，高蛋白，低纖維，低粗糧等結(jié)構(gòu)性改變，使得中國大腸癌出現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢，總體發(fā)病率也呈上升趨勢，已居我國常見惡性腫瘤第四位。在臨床上，大腸癌侵襲和/或轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，根據(jù)WHO的統(tǒng)計，被診斷為大腸癌早期階段的患者其五年生存率為百分之九十，然而，一旦大腸癌發(fā)展

2、至鄰近器官或淋巴結(jié)，其五年生存率將大大降低。僅有百分之三十九的患者被發(fā)現(xiàn)處于大腸癌的早期階段，因此，闡明大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是十分重要的。
　　 肽基脯氨酰同分異構(gòu)酶(peptidy-prolyl cis/trans isomerase PPIase，Pin1)是一種高度保守、特異的多肽脯氨?；樂串悩?gòu)酶(PPIase)，可特異性地催化磷酸化的脯氨酰前的絲氨酸或蘇氨酸位點(serine or threonine residu

3、es preceding proline，Ser/Thr-Pro基序)，使其發(fā)生順反異構(gòu)，從而改變底物蛋白的構(gòu)像，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。Pin1在人類多種惡性腫瘤中起著調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的重要作用，被稱為腫瘤發(fā)生、發(fā)展的催化分子，與腫瘤的增殖失控、血管形成、惡性侵襲有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Pin1在結(jié)直腸癌中過表達(dá)，并與結(jié)直腸癌進(jìn)展明顯相關(guān)。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步探討Pin1對結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力影響及作用機(jī)制。
　　 目的：

4、　　 1.構(gòu)建針對Pin1基因的RNA干擾真核表達(dá)載體(pGenesil-1-PIN1，簡寫p-shRNA)。
　　 2.觀察pGenesil-1-PIN1對大腸癌SW480和SW620細(xì)胞中Pin1基因的表達(dá)的抑制作用。
　　 3.探討Pin1基因沉默后對大腸癌SW480和SW620細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，初步分析其發(fā)揮作用的可能分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.合成針對Pin1基因的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)真核表達(dá)

5、載體pGenesil-1-PIN1與其對照載體pGenesil-1-CON(簡寫p-CON)經(jīng)雙酶切瓊脂糖凝膠電泳及DNA測序鑒定正確。
　　 2.在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將真核表達(dá)質(zhì)粒p-shRNA和p-CON分別轉(zhuǎn)染人大腸癌細(xì)胞株SW480和SW620，提取總蛋白質(zhì)，應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測其對Pin1蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。
　　 3.利用細(xì)胞劃痕實驗檢測SW480和SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-shRNA質(zhì)?；騪-CON質(zhì)

6、粒后的遷移能力，采用Boydenchamber實驗檢測SW480和SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 4.用明膠酶譜法檢測SW480和SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-shRNA質(zhì)粒或p-CON質(zhì)粒后表達(dá)MMP-2及MMP-9蛋白活性的變化。
　　 5.凝膠遷移率變動分析(EMSA)檢測在Pin1干擾后NF-κB活性的變化，以及檢測Pin1干擾后SW480和SW620細(xì)胞核蛋白與MMP-9-NF-κB寡核苷酸探針的結(jié)合情況。

7、
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建針對Pin1基因的RNA干擾真核表達(dá)載體。
　　 2.轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，SW480/p-shRNA(干擾組)中Pin1蛋白表達(dá)的灰度值為(0.49±0.07)，SW480/p-CON(對照組)中為(0.94±0.09)，SW480(未處理組)中為(1.01±0.11)(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后，SW620/p-shRNA組中Pin1蛋白表達(dá)的灰度值為(0.44±0

8、.11)，SW620/p-CON組中為(0.98±0.10)，SW620組中為(0.99±0.09)。轉(zhuǎn)染pGenesil-1-PIN1后，可以抑制SW480和SW620細(xì)胞中Pin1蛋白的表達(dá)。
　　 3.轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，SW480/p-shRNA組中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的灰度值分別為(0.39±0.08)和(0.45±0.07)，SW480/p-CON組中分別為(0.82±0.07)和(0.83±0.07)，

9、SW480組中分別為(0.84±0.07)和(0.93±0.05)。轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后，SW620/p-shRNA組中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的灰度值分別為(0.32±0.04)和(0.41±0.09)，SW620/p-CON組中分別為(0.76±0.03)和(0.94±0.07)，SW620組中分別為(0.76±0.01)和(0.95±0.05(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染pGenesil-1-PIN1后，可以抑制SW480和SW62

10、0細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)。
　　 4.抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究發(fā)現(xiàn)，SW480和SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGenesil-1-PIN1后體外侵襲轉(zhuǎn)移能力下降：劃痕擦傷后實驗組細(xì)胞平面遷移能力明顯降低；Boydenchamber實驗顯示，SW480/p-shRNA組約有(49.6±7.2)個細(xì)胞穿過了聚碳酸酯膜，SW480/p-CON組約(90.2±6.5)個細(xì)胞；SW620/p-shRNA組約(52.7±4.4)個細(xì)胞，

11、SW620/p-CON組約(96.4±3.9)個細(xì)胞穿過了聚碳酸酯膜(P＜0.05，Student'st-test)。
　　 5.EMSA結(jié)果顯示，SW480和SW620細(xì)胞中的核蛋白可與NF-κB寡核苷酸探針發(fā)生特異性結(jié)合；轉(zhuǎn)染pGenesil-1-PIN1后，SW480和SW620細(xì)胞核蛋白與MMP-9-NF-κB寡核苷酸探針結(jié)合水平明顯下降。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建針對Pin1基因的RNA干擾質(zhì)粒，可