S100A在動脈粥樣硬化和斑塊去穩(wěn)定性中的致病機制及其對于不穩(wěn)定型心絞痛患者預后的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種慢性、進行性的、炎性相關的動脈疾病，主要累及大、中彈力動脈，它是以脂質(zhì)沉積、炎性細胞浸潤、平滑肌細胞遷移、細胞外基質(zhì)降解為主要特征的。其致病機理目前尚不明確，多項實驗證據(jù)表明，冠狀動脈粥樣硬化是以血管內(nèi)皮細胞功能障礙為始發(fā)事件，進展到由一系列的炎性細胞因子（IL-1β，TNF-α，MCP-1，IL-8，ICAM-1，VCAM-1等），基質(zhì)蛋白酶(M

2、MPs，Tryptase/Chymase，Serine proteinases plasminogen activator and plasminogen，Cathepsins，ADAMTSs等)參與，并伴有細胞增生的慢性血管炎癥。急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)是冠狀動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)歸的終末期表現(xiàn)。多項研究表明，冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，繼發(fā)血栓形成，導致冠狀動脈管腔急劇縮窄或者完全閉塞，這是不穩(wěn)

3、定型心絞痛，急性心肌梗死以及心源性猝死的主要病理生理機制。
　　 動脈粥樣硬化斑塊病灶內(nèi)的巨噬細胞成分決定著動脈粥樣硬化的進程，決定粥樣斑塊的穩(wěn)定性，并與血栓并發(fā)癥密切相關。四個緊密連接但又相互獨立的過程控制著粥樣硬化斑塊內(nèi)的巨噬細胞成分的變化，分別是:化學趨化，粘附，遷移和分化，凋亡（泡沫細胞）。國內(nèi)外大量資料表明，化學趨化因子(MCP-1，IL-8等)以及粘附分子（ICAM-1，VCAM-1等）在內(nèi)皮細胞或者其他動脈粥樣硬化

4、相關細胞的表達上調(diào)，對于粥樣硬化的進展以及斑塊的去穩(wěn)定性都有著較為深遠的影響。
　　 基質(zhì)蛋白酶參與了動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的全過程。大量的實驗證據(jù)表明細胞外基質(zhì)蛋白酶，如金屬基質(zhì)蛋白酶類(MMPs)、組織蛋白酶類(CathepsinK，S，L)、絲氨酸蛋白酶纖溶酶原激活物和纖溶酶原(Serine proteinase plasminogen activator and plasminogen)等在動脈粥樣硬化平滑的增生遷移以及

5、不穩(wěn)定斑塊纖維帽基質(zhì)細胞外成分的降解過程中都扮演著重要角色，它們的作用已毋庸質(zhì)疑。近年來，新型的金屬基質(zhì)蛋白酶ADAMTS家族又一次吸引了人們的注意力。ADAMTS蛋白酶是一類分泌型金屬蛋白酶，有著廣泛的作用底物。先前的實驗表明，ADAMTS4可能通過降解動脈粥樣硬化斑塊纖維帽內(nèi)的Versican成分誘使斑塊破裂，并可作為斑塊不穩(wěn)定的臨床標記物。但ADAMTS4在動脈粥樣硬化過程中的具體作用及其潛在的分子調(diào)控機制目前尚不明確。
　

6、　 他汀類藥物(HMG-CoA還原酶抑制劑，Statins)目前已被廣泛的應用于降低升高的脂質(zhì)水平和心血管危險度。近年來大量證據(jù)表明，除去為大家所熟知的明確的降低膽固醇的作用之外，他汀類藥物至少還可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應、改善內(nèi)皮功能，下調(diào)粘附分子和化學趨化因表達，對抗氧化應激等機制，使心血管病患者獲益。他汀類藥物獨立于降低膽固醇的作用之外，在穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)動脈硬化斑塊方面的多效性，使得它在冠心病的短期治療（不穩(wěn)定心絞痛，急性心肌梗死）以及長

7、期治療（慢性穩(wěn)定性冠心?。┲委煯斨芯加幸幌亍Ｎ覀兿嘈?，隨著研究的不斷深入，他汀類藥物在抗動脈粥樣硬化方面將會有更多的作用被發(fā)現(xiàn)，更多的效應通路會被闡明。
　　 不穩(wěn)定型心絞痛（Unstable angina pectoris，UAP）是動脈粥樣硬化斑塊失穩(wěn)定性最常見的臨床表現(xiàn)類型。據(jù)統(tǒng)計，不穩(wěn)定心絞痛患者一年內(nèi)發(fā)生急性心肌梗死的概率達12-13％，死亡率更高達3-18％。因此，加強對不穩(wěn)定心絞痛患者監(jiān)控和治療，對預防急性心

8、肌梗死發(fā)生，降低死亡率有著重要意義。所以，尋找一種安全、簡單，方便，無創(chuàng)，有效的監(jiān)控手段或者生物學指標對心血管醫(yī)生來說是目前的首要任務。
　　 S100A4屬于鈣結合蛋白S100家族，最先發(fā)現(xiàn)于小鼠腎上腺癌細胞中，后證實，S100A4在多種腫瘤組織中高表達，并與腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移、血管浸潤、惡性程度、TMN分期等密切相關，并可作為評價腫瘤預后的獨立預測因子。S100A4可在幾乎所有的細胞類型中表達，在發(fā)揮細胞內(nèi)功能的同時，又可以共

9、價結合二聚體的形式分泌的細胞外，發(fā)揮細胞外功能。除惡性腫瘤相關外，現(xiàn)有的動物和臨床資料表明，S100A4還可能參與了一系列炎性相關疾病的病理生理過程，如類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)，牛皮癬（Psoriasis），炎性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBS），特發(fā)性炎性肌病(Idiopathic inflammatory myopathy，IIM)等。最近，研究者在同樣為炎性失

10、調(diào)的動脈粥樣硬化斑塊以及冠脈血運重建術后再狹窄的病灶中發(fā)現(xiàn)了高表達S100A4。一項最新的研究結果顯示，在冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊中S100A4表達也明顯上調(diào)，這提示S100A4可能也與斑塊的去穩(wěn)定性有關。
　　 鑒于炎癥與動脈粥樣硬化和斑塊去穩(wěn)定性的密切關系，我們提出了一個很誘人的假設:S100A4參與了冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的過程，并可能代表一種新的斑塊去穩(wěn)定性的機制，促使斑塊破裂，誘發(fā)急性心臟事件。為了驗證這個的假設，我們采

11、用了臨床和實驗相結合的實驗方法，并著重觀察其對血管內(nèi)皮細胞中化學趨化因子(MCP-1，IL-8)和粘附分子(ICAM-1，VCAM-1)以及單核/巨噬細胞中新型金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-9和ADAMTS4的調(diào)控作用。同時，我們以活體和體外研究相結合的方式研究了他汀類藥物對于S100A4釋放的調(diào)控作用。最后，我們評價了外周血S100A4水平對于UAP患者短期主要心血管事件的預測價值。
　　 方法：
　　 1.冠狀動脈粥樣硬化性

12、心臟病患者外周血S100A4水平檢測
　　 選取因懷疑為CAD而入院行擇期CAG手術的患者78人。所有患者術前股動脈取血，ELISA方法分別檢測外周血S100A4，hs-CRP和ADAMTS4濃度水平。根據(jù)CAG結果，將病人分為造影CAD組和對照組，分別比較兩組患者外周血S100A4，hs-CRP和ADAMTS4濃度水平，并利用二元多因素logistic回歸分析尋找與造影CAD獨立相關的因素。另外，我們還入選了經(jīng)CAG證實的CA

13、D患者91例，其中UAP59例，SAP32例。健康對照組為30例年齡和性別相匹配的健康成年人，所有患者均于入院后即刻肘靜脈無菌取血，ELISA方法分別檢測外周血S100A4和hs-CRP濃度水平。ROC曲線用于分析和比較S100A4和hs-CRP水平診斷UAP的效能。以患者CAG為結果為基礎，根據(jù)病人的臨床癥狀和心電圖所見確定罪犯血管，并按照Ambrose's分類法將脈罪犯血管病變的斑塊分為簡單病變和復雜病變，分別比較罪犯病變斑塊形態(tài)為

14、簡單病變和復雜病變的SAP和UAP患者的外周血S100A4水平，并利用二元多因素logistic回歸分析尋找與CAG復雜病變獨立相關的因素。
　　 2.動脈粥樣硬化斑塊中S100A4的表達和釋放
　　 連續(xù)隨機入選入院行頸總動脈內(nèi)膜切除術的病人10例，根據(jù)病人在手術之前的6個月內(nèi)是否發(fā)生過同側(cè)中風、短暫性腦缺血發(fā)作以及短暫性黑蒙等腦血管癥狀將他們分為有癥狀頸總動脈斑塊組合無癥狀行頸總動脈斑塊組。通過頸總動脈內(nèi)膜切除術獲得

15、的斑塊組織速凍于液氮中，Trizol提取總RNA，半定量RT-PCR擴增S100A4與CD68基因，以管家基因GADPH作為內(nèi)參照。另外，入選以穩(wěn)定心絞痛入院行PCI手術患者6例，分別于PCI手術之前，手術后2小時、4小時、8小時以及24小時取血。ELISA方法測定血樣S100A4水平變化。
　　 3.S100A4的炎性調(diào)控
　　 將THP-1細胞以5x105個/ml密度接種于24孔板中，暴露于終濃度為160nmol/m

16、l的PMA中，72小時后換液。RT-PCR以及Western-blot方法檢測THP-1細胞分化前后S100A4mRNA以及蛋白表達水平的變化。同時，向分離自UAP(n=9)，SAP(n=9)以及健康成年人(n=9)的外周血單個核細胞(PBMCs)中分別加入oxLDL(20ng/ml)或者IL-1β(10ng/ml)，孵育24小時后，取無細胞上清，ELISA法測定S100A4濃度。另外，分別應用oxLDL(20ng/ml)或者IL-1β

17、(10ng/ml)單獨或者共同刺激THP-1巨噬細胞以及HUEVCs，24小時后取細胞上清液，ELISA法測定S100A4濃度。
　　 4.S100A4的生物學效應
　　 分別以不同的rhS100A4濃度（空白，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml和2000ng/ml）刺激THP-1巨噬細胞6小時和18小時，取細胞上清。在另外單獨的實驗中，THP-1巨噬細胞以PTDC(終濃度10umol/l)預處理30

18、分鐘，然后再加入終濃度為1000ng/ml的rhS100A4刺激24小時，取細胞上清。分別以ELISA法檢測各組細胞上清液中MMP-9和ADAMTS4濃度。分別以不同的rhS100A4濃度（空白，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml和2000ng/ml）刺激HUEVCs6小時和24小時，戊二醛固定內(nèi)皮細胞，細胞ELISA法檢測內(nèi)皮細胞表面ICAM-1和VCAM-1的表達（6小時），ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中MCP

19、-1和IL-8濃度（24小時）。在Transwell實驗中，上室中加入密度為2×105個/ml的THP-1單核細胞，下室中分別加入濃度遞增的rhS100A4（空白，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml和2000ng/ml），細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，5％CO2孵育30分鐘，取出小室，棄去上室培養(yǎng)基，4％多聚甲醛固定，蘇木素染色后，光學顯微鏡下隨機選取5個高倍鏡視野計數(shù)。另外，在單獨的實驗中，個別實驗組在下室中預先加入S100

20、A4中和抗體（終濃度20ug/ml），然后再加入終濃度為1000ng/ml的rhS100A4，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，5％CO2孵育30分鐘，按照上述步驟染色計數(shù)。
　　 5.他汀類藥物對于S100A4水平的影響
　　 選取經(jīng)CAG證實為冠心病，但之前沒有接受過他汀類藥物治療的病人36例，其中UAP20例，SAP16例，所有患者簽訂知情同意書后開始阿托伐他汀(20mg/d)治療，分別于治療開始前和治療開始后1個月時空腹肘靜脈

21、取血，檢測血脂以及S100A4水平。在體外實驗中，為了盡可能準確的模擬動脈粥樣硬化條件下的真實的病理生理情況，HUEVCs和THP-1巨噬細胞分別用oxLDL（20ng/ml）刺激24小時，更換無血清培養(yǎng)基，然后再次加入終濃度為20ng/ml的IL-1β(10ng/ml)刺激24小時，其中他汀組在加入IL-1β之前，預先加入終濃度為10μmol/l的鄰羥基阿托伐他汀孵育2小時。ELISA法測定上清中S100A4含量。在另外單獨的試驗中，

22、HUEVCs和THP-1巨噬細胞分別加入鄰羥基阿托伐他?。?0μmol/l）預處理2小時，然后再加入IL-1β(10ng/ml)刺激，分別于6小時和24小時收取細胞，Real-timePCR和Western-blot法比較S100A4在mRNA和蛋白水平的變化。
　　 6.外周血S100A4對于不穩(wěn)定型心絞痛患者短期預后的預測價值
　　 連續(xù)隨機入選不穩(wěn)定心絞痛患者59人，隨訪終點為:(1)心源性死亡(2)非致命性心肌梗

23、死(3)再發(fā)需要入院治療的不穩(wěn)定心絞痛。鑒于該隨訪隊列病人的數(shù)量，我們進一步根據(jù)隨訪病人的外周血S100A4水平的四分位間距將病人分為四組，比較四組6個月心血管事件發(fā)生的相對危險度。同時，應用二元多因素logistic回歸分析確定與UAP患者隨訪期間主要心血管不良事件(MACE)的發(fā)生獨立相關的因素。
　　 結果：
　　 1.經(jīng)CAG正常的患者相比較，經(jīng)CAG證實的慢性穩(wěn)定性心絞痛（chronicstableangina

24、，CAS）患者血清S100A4濃度明顯升高(436.5±151.0vs76.6±28.1，P＜0.001)。與之相似的，造影CAD患者的外周血hs-CRP和ADAMTS4水平也均明顯高于CAG正常的患者（hs-CRP:2.86±2.42vs1.40±0.80，P=0.005;ADAMTS4:72.25±15.64vs40.65±7.12,P＜0.001）。同時，Logistic回歸分析結果顯示，外周血S100A4和ADAMTS4水平分別

25、于與造影CAD獨立相關(S100A4:OR=1.020，95％CI=1.005-1.035，P=0.009;ADAMTS4:OR=1.137，95％CI=1.002-1.291，P=0.047)。在另外的臨床觀察中，我們發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比較，UAP和SAP組，血清S100A4水平均明顯升高，尤其以UAP最為明顯（UAP:346.2±106.30ng/ml;SAP:565.0±128.1ng/ml;健康對照組:99.0±44.7ng/

26、ml，P＜0.01）。在UAP患者中，血清S100A4水平與ADAMTS4和hs-CRP水平呈正相關(r=0.473，P=0.001)。在UAP患者中，S100A4水平在復雜病變組顯著高于簡單病變組（445.01±99.06ng/mlvs596.30±117.94ng/ml，P＜0.001），而在SAP患者中，S100A4水平在復雜病變組也趨向于升高，但無統(tǒng)計學差異。二元多因素logistic回歸分析結果顯示，無論在CAD患者還是在UA

27、P患者中，S100A4水平均與復雜病變獨立相關(CAD:OR=1.009,95％CI=1.001-1.017,P=0.031;UAP:OR=1.010,95％CI=1.001-1.019,P=0.028)。
　　 2.與無癥狀組的頸總動脈斑塊相比，S100A4mRNA表達水平在有癥狀組中顯著升高(P=0.0047)。Pearson相關性分析顯示，在所有頸總動脈斑塊中S100A4mRNA表達水平與CD68mRNA表達水平程正相關(

28、r=0.66，P=0.038)。在接受PCI治療的SAP患者中，血清S100A4的水平在PCI術后逐漸升高，在術后第2小時達峰，后緩慢下降，至術后24小時恢復至術前水平。
　　 3.THP-1細胞分化成為巨噬細胞后，S100A4mRNA以及蛋白的表達水平明顯上調(diào)(P＜0.001，P＜0.05)。oxLDL和IL-1β能夠較為明顯的誘導S100A4的釋放，這種作用在分離自UAP病人的PMBCs中最為明顯。在THP-1巨噬細胞中，I

29、L-1β和oxLDL也能夠顯著的誘導S100A4的釋放（35.39±3.02ng/mlvs65.70±3.35ng/mlvs55.36±4.99ng/ml，P＜0.001），并且二者具有疊加效應（91.24±6.42ng/ml，P=0.002）。然而，在HUEVCs中，IL-1β和oxLDL單獨刺激對于細胞上清液中S100A4濃度影響不大（17.70±1.39ng/ml，19.75±1.12ng/ml，19.58±0.97ng/ml，P

30、=0.137），但當二者共同刺激HUEVCs后，S100A4的濃度顯著升高近2倍（36.15±3.77ng/ml，P＜0.001）。
　　 4.在THP-1巨噬細胞中，隨著rhS100A4刺激濃度的逐漸升高，細胞上清中MMP-9的濃度水平也逐漸升高，并且這種效應以刺激18小時時最為顯著。rhS100A4誘導的THP-1巨噬細胞上清中ADAMTS4的釋放也表現(xiàn)為類似的趨勢。NF-(k)B抑制劑PTDC（10umol/l）能夠有效的

31、抑制甚至完全消除rhS100A4誘導的THP-1巨噬細胞上清中MMP-9和ADAMTS4的分泌(P值均小于0.05)。應用不同濃度的rhS100A4刺激HUEVCs，細胞上清中MCP-1的濃度水平隨著rhS100A4濃度的升高而升高。同樣的，HUEVCs中IL-8的分泌也具有rhS100A4濃度的依賴性。Transwell實驗的結果表明，不同濃度的（從100ng/ml-2000ng/ml）rhS100A4蛋白對THP-1單核細胞均具有顯

32、著的化學趨化活性(P值均小于0.05)。向Transwell下室中加入S100A4中和抗體（終濃度20ug/ml）則能夠完全阻斷rhS100A4(1000ng/ml)誘導的THP-1細胞趨化（P＜0.05）。
　　 5.經(jīng)過1個月的他汀治療，冠心病患者外周血S100A4水平明顯降低（他汀治療前:482.98±153.63ng/ml;他汀治療后:396.18±125.87ng/ml，P=0.011），Pearson相關分析顯示他汀

33、的這種作用是獨立于他汀的調(diào)脂作用之外的（r=-0.087，P=0.613）。體外實驗結果顯示，鄰羥基阿托伐他汀(10umol/l)能夠顯著地降低IL-1β(10ng/ml)誘導的THP-1巨噬細胞中S100A4的釋放（IL-1β刺激組:321.17±29.28ng/mlvsIL-1β+他汀組:190.35±9.44ng/ml，P=0.02），然而，鄰羥基阿托伐他汀對于S100A4的基礎釋放水平?jīng)]有影響（他汀組:118.86±13.50n

34、g/mlvs空白對照組:113.92±8.46ng/ml，P=0.621）。在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUEVCs)中也觀察到了類似的結果。另外，鄰羥基阿托伐他汀并不能影響IL-1β誘導的THP-1巨噬細胞和HUEVCs中S100A4mRNA的表達水平，但卻能夠使細胞內(nèi)S100A4蛋白的表達顯著上調(diào)（P＜0.05）。
　　 6.至隨訪結束時，共有21例終點事件發(fā)生:心源性死亡2例，非致命性心肌梗死3例，再發(fā)不穩(wěn)定心絞痛16例。與沒有發(fā)

35、生終點事件的患者相比，發(fā)生終點事件的患者在入院時有著較高的外周血S100A4水平(656.9.5±97.8ng/mlvs522.3±124.9ng/ml，P=0.001)。同時，患者6個月心發(fā)生血管事件的相對危險對隨著S100A4水平的升高而升高，并有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。二元多因素logistic回歸分析結果顯示，在UAP患者中，外周血S100A4水平和治療方式與隨訪6個月MACE獨立相關(OR=1.010，95％CI:1.0

36、03-1.020,P=0.007)。
　　 結論：
　　 1.S100A4在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)局部上調(diào)并受炎性調(diào)控，并可能至少部分通過誘導血管內(nèi)皮細胞化學趨化因子(MCP-1、IL-8)和粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)的分泌和表達，加強單核細胞的化學趨化以及調(diào)控單核/巨噬細胞基質(zhì)蛋白酶(MMP-9、ADAMTS4)分泌等機制，活化血管內(nèi)皮細胞和單核/巨噬細胞，從而增強炎癥反應和細胞外基質(zhì)的降解，參與了動脈粥樣硬化