5-Aza-dC在轉錄水平促進喉癌細胞MYCT1-TV基因表達的分子機制研究.pdf

1、前言:
　　 喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一。其病理類型主要為喉鱗狀細胞癌(LSCC)。近年來,喉癌的發(fā)病率逐步上升。我國東北地區(qū)喉癌發(fā)病率居于頭頸部腫瘤首位。喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究將為喉癌的預防和基因診治提供重要的分子靶標。
　　 腫瘤抑制基因(TSG)的失活在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。啟動子區(qū)CpG島的高甲基化可引起TSG表達沉默,使細胞出現(xiàn)無節(jié)制生長,導致腫瘤的發(fā)生。
　　 5-氮-2'-脫氧胞苷

2、(5-Aza-dC)是一種DNA甲基化轉移酶抑制劑,其通過去甲基化作用使因為CpG島甲基化而失活的TSG重新表達,獲得腫瘤抑制功基因功能。
　　 在前期工作中,我們應用cDNA末端快速擴增(RACE)技術發(fā)現(xiàn)喉癌基因MYCT1的一個新的轉錄本,命名為MYCT1-TV。RT-PCR結果顯示,該基因在腫瘤細胞系中的表達水平顯著低于正常細胞系,在喉癌組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織。轉染MYCT1-TV-GFP表達載體的Hep2細

3、胞存活率下調,凋亡率增高,細胞侵襲能力降低,揭示MYCT1-TV可能具有TSG特性。利用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)、凝膠電泳遷移率分析(EMSA)和染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗結果證實癌基因c-Myc通過結合MYCT1-TV啟動子區(qū)E-box元件而發(fā)揮轉錄因子的作用。亞硫酸鹽測序PCR(BisulritesequencingPCR,BSP)檢測結果顯示MYCT1-TV啟動子區(qū)E-box元件中CpG的胞嘧啶均被甲基化(文章已被接收,B

4、MCCancer,2012)。我們推測MYCT1-TV啟動子區(qū)E-box元件甲基化將干擾其與c-Mvc的結合。
　　 在本項目中,我們擬應用甲基化轉移酶抑制劑5-氮-2'-脫氧胞苷(5-Aza-dC)對喉癌Hep2細胞進行去甲基化處理,通過半定量RT-PCR和qPCR、BSP和ChIP實驗分別檢測處理前后MYCT1-TV基因轉錄水平、E-box序列的甲基化狀態(tài)和E-box元件與c-Myc結合能力的變化;另一方面,通過EMSA實驗

5、檢測啟動子E-box元件甲基化狀態(tài)對其與轉錄因子c-Myc結合能力的影響。
　　 材料與方法:
　　 5-Aza-dC(4μmol/L)處理喉癌Hep2細胞,利用RT-PCR和qPCR檢測處理前后MYCT1-TV基因的mRNA表達水平,BSP檢測處理后E-box序列的甲基化狀態(tài)。利用EMSA和ChIP實驗檢測甲基化對MYCT1-TV基因與轉錄因子c-Myc結合能力的影響。
　　 實驗結果:
　　 1、5-

6、Aza-dC處理前后喉癌Hep2細胞中MYCT1-TV基因與beta-actinmRNA表達水平的灰度值之比分別為0.2085±0.0234和1.2821±0.04,差異具有顯著性(P＜0.05);MYCT1-TV基因與GAPDHmRNA表達水平的kQ值之比分別為1±0.2450和6.11±0.4582,差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　 2、BSP結果顯示5-Aza-dC處理后喉癌Hep2細胞中MYCT1-TV基因E-bo

7、x序列發(fā)生去甲基化。
　　 3、EMSA實驗結果顯示MYCT1-TV基因E-box序列甲基化特異性探針與核蛋白有微弱的結合,提示E-box序列甲基化干擾了MYCT1-TV基因與c-Myc的結合。
　　 4、ChIP實驗結果表明5-Aza-dC處理Hep2細胞后E-box序列與c-Myc結合能力較處理前顯著增強,處理前后E-box與Input灰度值之比分別為0.1391±0.0225和0.4964±0.0134,差異具有顯