黃芪總皂甙保護(hù)心肌損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的:提取黃芪的活性成分——黃芪總皂甙,在培養(yǎng)心肌細(xì)胞損傷模型和大鼠心肌損傷模型上,利用離子成像系統(tǒng)、膜片鉗技術(shù)及分子生物學(xué)方法,研究黃芪總皂甙對(duì)損傷心肌細(xì)胞膜鈣離子通道,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷、肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶活性、鈣調(diào)節(jié)蛋白、心肌能量代謝及脂質(zhì)過氧化的影響.探討黃芪總皂甙對(duì)心肌細(xì)胞鈣失衡調(diào)節(jié)的作用機(jī)制.方法:1.培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞,用異丙腎上腺素干預(yù)造成培養(yǎng)心肌細(xì)胞損傷模型,同時(shí)分別給予下列藥物作用細(xì)胞72小時(shí),分為正常

2、對(duì)照組(C)、異丙腎上腺素?fù)p傷組(ISO)、低劑量黃芪總皂甙單獨(dú)作用組(AS<,1>,10 mg/L)、高劑量黃芪總皂甙單獨(dú)作用組(AS<,2>,100mg/L)、低劑量黃芪總皂甙干預(yù)組(ISO+AS<,1>)、高劑量黃芪總皂甙干預(yù)組(ISO+AS<,2>)、美托洛爾干預(yù)組(ISO+M)、維拉帕米干預(yù)組(ISO+V).檢測(cè)培養(yǎng)心肌細(xì)胞上清中心肌肌鈣蛋白Ⅰ含量.2.培養(yǎng)心肌細(xì)胞按上述藥物干預(yù)72小時(shí)后,負(fù)載熒光染料Fura-2/AM,用離

3、子成像系統(tǒng)檢測(cè)單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度;在細(xì)胞旁快速加入咖啡因(10mmol/L),觀察細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變,了解細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷變化;用半定量RT-PCR方法,檢測(cè)心肌細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)蛋白:肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶(SERCA),受磷蛋白(phospholamban),蘭尼丁受體(ryanodine receptor)及L-型鈣通道(L-Ca<'2+> channel)的mRNA表達(dá);對(duì)心肌細(xì)胞SERCA活性進(jìn)行測(cè)定.3.檢測(cè)各組細(xì)胞超氧化物歧化酶活

4、性和丙二醛含量,了解黃芪總皂甙對(duì)損傷心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的影響.4.雄性SD大鼠,體重220g-260g,背部皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素(5mg/kg/day)2次,造成心肌缺血損傷模型.在給予異丙腎上腺素的同時(shí),分別腹腔注射下述藥物,分組為:正常組(N)、損傷組(ISO)、黃芪總皂甙治療組(As)、曲美他嗪治療組(TMZ)、普萘洛爾治療組(PRO).藥物連續(xù)注射7天后,處死大鼠,取心尖部心肌,HE染色,觀察心肌病理形態(tài)變化;取左心室,測(cè)定

5、心肌中乳酸和丙二醛含量;用高效液相色譜法檢測(cè)左室心肌中ATP、ADP、AMP含量.5.應(yīng)用Langendorff灌流裝置,逆行灌流上述各組大鼠心臟,膠原酶消化分離單個(gè)心室肌細(xì)胞,用離子成像系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠心室肌單個(gè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度及肌漿網(wǎng)鈣釋放功能.6.利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),記錄大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道電流,比較各組大鼠間L型鈣通道電流密度、電流密度-電壓曲線以及電流失活常數(shù);并觀察不同濃度的黃芪總皂甙對(duì)正常大鼠心肌細(xì)胞L型鈣電流的