siRNA靶向沉默F(xiàn)LIP基因?qū)η傲邢侔㏄C3細(xì)胞的體外抑制作用.pdf

1、背景與目的:
　　Fas相關(guān)死亡域樣白介素1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(cellular-FLICE inhibitory protein,c-FLIP),簡(jiǎn)稱(chēng)FLIP,研究發(fā)現(xiàn)其過(guò)量表達(dá)于各類(lèi)腫瘤細(xì)胞中,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Fas, TNFR-1, DR4及TRAILR等死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中的caspase-8(半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8)凋亡蛋白而阻止細(xì)胞凋亡程序,促使腫瘤細(xì)胞過(guò)量生長(zhǎng)。FLIP過(guò)量表達(dá)于PCa細(xì)胞,抑制細(xì)胞凋亡,

2、維持細(xì)胞過(guò)量生長(zhǎng),可能是PCa基因治療的有效靶點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)siRNA靶向沉默PC3細(xì)胞中FLIP基因的表達(dá),探討其作為PCa基因治療靶點(diǎn)的可行性。
　　方法:
　　將體外培養(yǎng)的 PC3細(xì)胞分為空白對(duì)照組(僅加培養(yǎng)基),陰性對(duì)照組(NC-siRNA,脂質(zhì)體)實(shí)驗(yàn)組(FLIPL-siRNA,脂質(zhì)體)。QPCR檢測(cè)PC3細(xì)胞FLIPL mRNA,caspase-8 mRNA表達(dá)水平;western blot檢測(cè)PC3細(xì)胞FL

3、IPL蛋白表達(dá)水平;MTT法檢測(cè)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC3細(xì)胞凋亡率及Transwell模型檢測(cè)PC3細(xì)胞侵襲性。
　　結(jié)果:
　　1)FLIPL-siRNA轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞后48h,QPCR檢測(cè)FLIPL mRNA表達(dá)水平。相對(duì)于空白PC3組與陰性對(duì)照PC3組,實(shí)驗(yàn)組PC3細(xì)胞的FLIPL mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.001);siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3和siRNA-4的抑制率分別為

4、(69.9士2.2)％、(65.7士2.3)%、(75.4士1.6)%和(70.3士3.2)%,其中siRNA-3的抑制作用最強(qiáng)(P<0.05);而空白PC3組和陰性對(duì)照PC3組之間FLIPL mRNA的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。siRNA-3組的caspase-8 mRNA表達(dá)水平較空白組和陰性對(duì)照組顯著升高(P<0.001),且空白組與陰性對(duì)照組之間的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2)FLI

5、PL-siRNA轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞后48h,Western blot法檢測(cè)FLIPL蛋白表達(dá)水平。相對(duì)于空白PC3組, siRNA-3 PC3組的FLIPL蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。
　　3)MTT,流式細(xì)胞術(shù),Transwell模型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siRNA-3對(duì)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,凋亡率,侵襲性等生物學(xué)特征的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FLIP靶向特異性siRNA能在轉(zhuǎn)錄和翻譯