積雪草苷和羥基積雪草苷抗心肌缺血及缺血再灌注損傷作用和機制研究.pdf

1、中藥積雪草是傘形科植物積雪草[Centella asiatica(L.)Urban]的干燥全草，為各版《中國藥典》收藏品種，主要含有三萜皂苷類成分，被認(rèn)為是一種具有治療各種熱癥、癰疽、瘰疬等功效的藥物。積雪草苷(asiaticoside，AC)及羥基積雪草苷(madecassoside，MC)是積雪草三萜皂苷類的主要成分。本實驗室在前期的研究中通過體外藥物篩選實驗首次發(fā)現(xiàn)AC和MC這兩種化合物可有效保護(hù)大鼠原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，同時

2、具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，通過離體動脈條實驗還證明積雪草苷類化合物具有擴張小動脈的作用，實驗結(jié)果表明AC和MC化合物可能具心血管活性。 本研究利用離體、整體動物急性心肌缺血及心肌缺血再灌注損傷(myocardialischemia reperfusion injury,MIRI)模型，以心功能、血清酶活性、心肌梗塞面積等為指標(biāo)，深入研究AC及MC對心肌缺血預(yù)防和治療作用，再根據(jù)實驗中發(fā)現(xiàn)的藥物作用特點進(jìn)一步研究其在細(xì)胞、分子水

3、平的作用機制。 1.積雪草苷抗心肌缺血活性及其可能機制 制備大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，AC預(yù)處理后，記錄不同時間點冠脈流量和心肌收縮力，用定量組織化學(xué)染色方法計算心肌梗死面積；預(yù)先給予AC，制備急性心肌缺血病理模型，計算心肌梗死面積，檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)，、超氧化物岐化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)含量；在預(yù)防給藥情況下，制備在體兔心肌缺血再灌注損傷模型

4、，采用生理多導(dǎo)儀檢測心率(HR)、血壓(BP)、心功能等血流動力學(xué)指標(biāo)，檢測血清中LDH、CK活性，ELISA法測定血清中C反應(yīng)蛋白(CRP)含量，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果顯示AC可明顯減小左心及全心心肌梗死面積，具有劑量依賴性，能明顯改善心功能，作用特點在于對血壓和心率無影響。 在進(jìn)行相關(guān)機理研究中發(fā)現(xiàn)，AC可降低心肌缺血所致的MDA含量升高程度，升高SOD活性，具有清除血清中氧自由基作用；AC可降低心肌缺血再灌

5、注損傷所致的CRP升高程度，可能具有抗炎活性，從而降低心肌缺血損傷程度；AC可明顯減少心肌細(xì)胞凋亡，可能具有抗凋亡活性。 2．羥基積雪草苷抗心肌缺血再灌注損傷活性及其可能機制 制備大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，MC預(yù)處理后，記錄不同時間點冠脈流量和心肌收縮力，用定量組織化學(xué)染色方法計算心肌梗死面積；制備兔心肌缺血再灌注損傷(MIRI)模型，缺血前靜脈滴注MC，多時間點檢測心電圖、血流動力學(xué)等指標(biāo)，用定量組織化學(xué)染色方法

6、計算心肌梗死面積，檢測血清中酶活性及MDA含量，ELISA法測定血清中C反應(yīng)蛋白(CRP)含量，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡，SP法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白BCl-2表達(dá)；在此模型基礎(chǔ)上，改變給藥時間窗，再灌注時靜脈滴注MC，多時間點檢測心電圖、血流動力學(xué)等指標(biāo)，用定量組織化學(xué)染色方法計算心肌梗死面積，檢測血清中酶活性及MDA含量，考察MC對缺血再灌注損傷的治療作用；制備大鼠缺血再灌注所致心率失常模型，采用生理多導(dǎo)儀記錄心電圖，記錄首次心率

7、失常發(fā)生的時間及再灌注至心電圖恢復(fù)正常所持續(xù)時間；制備原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，預(yù)先給予MC，采用熒光探針法檢測心肌細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度、活性氧(ROS)水平，采用熒光素酶報告基因法檢測心肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量。 研究結(jié)果顯示MC在藥效學(xué)上可明顯減小左心及全心心肌梗死面積，具有一定量效關(guān)系；對相關(guān)的血清酶學(xué)指標(biāo)和心電圖有一定的改善作用；并能明顯改善心功能，降低平均動脈壓，且對心率無影響；再灌注時給予MC，明顯抑制血清中CK和L

8、DH的升高，改善心功能，且作用時間長于維拉帕米、作用強度優(yōu)于香丹注射液，對心肌缺血再灌注損傷有一定的治療作用；MC能明顯縮短再灌后心電圖異常持續(xù)時間，且在一定劑量上能明顯延遲首次發(fā)生時間，對缺血再灌注所致心律失常具有一定的抑制作用。 機制研究表明，MC可降低血清：MDA含量，升高SOD活性，能抑制脂質(zhì)過氧化過程，可降低原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧所致胞內(nèi)ROS升高水平，證明MC具有抗氧化活性，減輕自由基損傷；MC可降低血清中CRP升高