蛋白酶體抑制劑MG115對(duì)轉(zhuǎn)基因枸杞懸浮細(xì)胞表達(dá)重組HIV-1殼體蛋白含量影響的初步研究.pdf

1、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（HIV－1）是引起艾滋病全球性流行的主要病原體，HIV感染已成為威脅人類健康及社會(huì)發(fā)展的主要問(wèn)題之一。P24殼體蛋白（capsid，CA）是HIV-1早期感染的一個(gè)重要標(biāo)志， CA的N-末端與少至4個(gè)基質(zhì)蛋白（Matric，MA）的氨基酸殘基結(jié)合可以形成球狀顆粒結(jié)構(gòu)，這種球狀結(jié)構(gòu)有利于病毒樣顆粒（Virus like particles，VLPs）結(jié)構(gòu)和功能的形成。動(dòng)物及Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，HIV CA VLPs

2、疫苗能夠引起機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 植物表達(dá)系統(tǒng)屬于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，利用植物生產(chǎn)重組蛋白具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括：降低攜帶動(dòng)物性病原體的危險(xiǎn)性、易于純化、不需特殊的運(yùn)輸和儲(chǔ)藏條件、植物培養(yǎng)基價(jià)格低廉降低生產(chǎn)成本、能進(jìn)行正確的轉(zhuǎn)譯后修飾加工使產(chǎn)生的外源蛋白具有生物學(xué)活性及形成多聚體等，因此被認(rèn)為是一個(gè)比微生物或動(dòng)物更理想的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。目前為止，已在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)了抗體、抗原疫苗、酶、酶抑制劑、細(xì)胞因子、凝血因子和激素等物

3、質(zhì)。 轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器表達(dá)重組蛋白安全、經(jīng)濟(jì)和有效，但是重組蛋白在植物中表達(dá)量非常低，僅占可溶性總蛋白的0．01％～0．4％。盡管從基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平等環(huán)節(jié)進(jìn)行了條件優(yōu)化，但是蛋白降解依舊是影響植物系統(tǒng)表達(dá)外源重組蛋白含量的重要因素。近年來(lái)利用植物懸浮細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白引起了人們的關(guān)注，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)無(wú)需支持物，可以大規(guī)模培養(yǎng)，而且培養(yǎng)條件可以人工調(diào)控，從而為生產(chǎn)高產(chǎn)量的重組蛋白奠定基礎(chǔ)。真核細(xì)胞內(nèi)大部分蛋白質(zhì)的降解是通

4、過(guò)泛素－蛋白酶體途徑，研究表明抑制蛋白酶體的活性可以提高細(xì)胞中蛋白的含量。在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入含有糜蛋白酶和胰蛋白酶樣抑制位點(diǎn)的絲氨酸蛋白酶抑制劑Ⅱ基因使轉(zhuǎn)基因水稻懸浮細(xì)胞的蛋白酶活性降低23％，重組蛋白人粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子的含量提高了2倍；將廣譜抑制劑組織蛋白酶D基因?qū)腭R鈴薯，外源基因表達(dá)產(chǎn)物TSP的產(chǎn)量提高20％-35％。 本課題組已將源于水稻的一個(gè)富含甘氨酸序列的信號(hào)肽（GRP）連接在MA4-CA融合基因的3’端，并將

5、該融合基因轉(zhuǎn)入到枸杞中，成功地建立了表達(dá)MA4-CA重組蛋白的轉(zhuǎn)基因植株及根分泌表達(dá)系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，本研究旨在利用轉(zhuǎn)基因枸杞愈傷組織建立懸浮細(xì)胞表達(dá)重組蛋白系統(tǒng)，并通過(guò)一系列濃度的特異性蛋白酶體抑制劑MG115作用于轉(zhuǎn)基因枸杞懸浮細(xì)胞，探討有效提高外源重組蛋白HIV-1 CA的可行性。 研究目的： 利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的分泌型植物表達(dá)載體，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌對(duì)枸杞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，建立轉(zhuǎn)基因枸杞的再生植株表達(dá)系統(tǒng)和懸浮細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

6、。在分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因枸杞蛋白酶體活性增強(qiáng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)蛋白酶體抑制劑MG115對(duì)懸浮細(xì)胞蛋白酶體活性的作用探討抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)基因枸杞懸浮細(xì)胞重組HIV-1殼體蛋白含量的影響，為進(jìn)一步研究植物HIV-1 CA VLPs疫苗及今后大量生產(chǎn)高純度的重組蛋白奠定基礎(chǔ)。 研究方法： （1）轉(zhuǎn)基因枸杞再生植株及懸浮細(xì)胞系的建立：應(yīng)用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，利用不同激素配比進(jìn)行枸杞愈傷誘導(dǎo)，分化誘導(dǎo)，利用愈傷組織篩選穩(wěn)定的表達(dá)重組蛋白CA的

7、懸浮細(xì)胞系統(tǒng)。 （2）表達(dá)重組HIV殼體蛋白轉(zhuǎn)基因枸杞懸浮細(xì)胞的鑒定：提取枸杞懸浮細(xì)胞基因組DNA，PCR擴(kuò)增分析轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)的目的基因；ELISA、Western blot及免疫組織化學(xué)方法鑒定轉(zhuǎn)基因枸杞中HIV CA的表達(dá)。 （3）轉(zhuǎn)基因枸杞懸浮細(xì)胞表達(dá)HIV CA含量的研究：選取生長(zhǎng)良好的枸杞懸浮細(xì)胞，分別加入一系列濃度的抑制劑MG115共培養(yǎng)，熒光底物法檢測(cè)懸浮細(xì)胞蛋白酶體活性的變化，ELISA、Western

8、blot及免疫組織化學(xué)方法觀察細(xì)胞內(nèi)HIV殼體蛋白含量的變化。 研究結(jié)果： （1）應(yīng)用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，利用6－BA、NAA、2，4－D和KT成功地進(jìn)行了枸杞的愈傷、再生芽及根系誘導(dǎo)，并利用愈傷組織建立了轉(zhuǎn)基因枸杞的懸浮細(xì)胞表達(dá)重組蛋白CA系統(tǒng)。 （2）PCR結(jié)果顯示MA4－CA融合基因成功導(dǎo)入枸杞中；Western blot證實(shí)轉(zhuǎn)基因枸杞中的MA4－CA融合蛋白以約55kDa存在：經(jīng)N－糖苷酶處理后，We

9、stern blot在37kDa和26kDa檢測(cè)到各有一條帶，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因枸杞懸浮細(xì)胞表達(dá)的CA為其糖基化形式。 （3）適宜濃度的MG115可以顯著性抑制蛋白酶體活性，ELISA、Western blot及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到50μM和100μM的MG115能有效提高轉(zhuǎn)基因枸杞懸浮細(xì)胞中HIV殼體蛋白的含量。 結(jié)論： 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化枸杞，成功地對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了分化誘導(dǎo)，并利用獲得抗性愈傷組織建立

10、了穩(wěn)定表達(dá)HIV CA的轉(zhuǎn)基因枸杞懸浮細(xì)胞系統(tǒng)。PCR結(jié)果表明MA4-CA融合基因已經(jīng)導(dǎo)入枸杞基因組中：Western blot表明CA以分子量55KDa左右存在于枸杞中，糖苷酶處理蛋白證實(shí)枸杞懸浮細(xì)胞表達(dá)的CA以糖基化形式存在；免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明MA4-CA主要分布于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。熒光底物法測(cè)定枸杞蛋白酶體活性發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因枸杞細(xì)胞蛋白酶體的活性為正常枸杞的4．2倍。ELISA、Western blot和immunohistolche