雞補體C3部分生物學特性的研究.pdf

1、補體是動物體液中重要的免疫物質，由40多種蛋白質組成，廣泛存在于血清、組織液和細胞膜表面，是具有精密調控機制的蛋白質反應系統(tǒng)，其活化過程表現(xiàn)為一系列絲氨酸蛋白酶的級聯(lián)酶解反應。多種微生物成分、抗原-抗體復合物以及其他外源性和內源性的物質可通過3條途徑(經(jīng)典激活途徑、旁路激活和途徑MBL激活途徑)激活補體，這3條途徑以裂解C3形成C3b相互交叉，由C3b形成不同的C5轉化酶(C4b2a3b、C3bBb)，激活補體C5開始共同的終末反應過程

2、，最后形成膜攻擊復合物(MAC)插入靶細胞，通過破壞靶細胞局部磷脂雙層而形成滲漏斑，或形成穿膜的親水性孔道，導致靶細胞崩解。可見補體C3是補體系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用的關鍵分子。在以上理論的指導下，本課題對雞補體C3的主要生物學特性進行了研究，探明了雞體內補體C3的分子量、含量以及C3的作用、作用原理進行了研究. 1.探明了雞與哺乳動物對細菌性疫苗免疫效果不同的原因。在實驗中，將078大腸桿菌活化，擴大培養(yǎng)，以甲醛滅活，蜂膠為佐劑制備大

3、腸桿菌顆粒性疫苗，免疫11日齡海藍褐蛋用公雛，制備大腸桿菌抗血清；將大腸桿菌抗血清中的補體滅活，使之與已定數(shù)量的大腸桿菌反應，形成抗原抗體復合物，然后加入不同動物的新鮮血清，通過細菌計數(shù)，觀察不同動物血清補體對大腸桿菌的清除能力；建立了微量血凝法測定動物血清補體效價，并對雞和幾種哺乳動物新鮮血清中的補體總活性進行測定。結果表明，單純抗體與活菌結合后，對細菌的清除作用影響微弱，而加入補體后，抗體殺滅細菌的能力明顯增強；經(jīng)比較，哺乳動物血清

4、中的補體對細菌的清除能力明顯高于雞；而豚鼠的補體的殺菌能力又明顯高于其他哺乳動物；對不同動物血清補體總活性的測定結果表明，成年SPF雞的補體總活性為25，低于兔、豬、牛、羊、豚鼠等哺乳動物，在這幾種哺乳動物中，豚鼠的血清補體總活性為28。由此證明：不同動物體內補體活性的差異是哺乳動物和雞對細菌性疫苗免疫效果不同的原因。 2.抗雞補體C3IgG的制備。按照雞補體C3的α鏈上羧基端第1272位到1292位的21個氨基酸殘基序列人工合

5、成模擬C3分子的21肽，以戊二醛作為交聯(lián)劑，與牛血清白蛋白載體偶聯(lián)結合，制成人工合成抗原復合物。將此人工合成抗原與弗氏佐劑混合乳化成油乳劑疫苗免疫注射家兔，制備成抗21肽血清，并用硫酸銨沉淀法提取抗血清中的IgG；采用間接ELISA方法測定抗21肽血清和IgG的抗體效價。結果表明，人工合成的C3分子的21肽復合抗原具有較強的免疫原性，制成的抗血清中的抗體效價達210，從抗血清中提取的IgG的抗體效價達215。 3.不同動物體內補

6、體C3的含量的測定。利用純化的抗21肽IgG，以間接ELISA方法測定雞和幾種哺乳動物體內補體C3的含量，結果表明，雞、豬、山羊、牛、豚鼠五種動物血清中的補體C3含量分別為0.34±0.005mg/ml、1.47±0.008mg/ml、1.70±0.005mg/ml、1.78±0.007mg/ml和4.18±0.008mg/ml。以上結果顯示，雞體內的C3含量明顯低于其他幾種動物，差異極顯著(p＜0.01)。 4.抗雞補體C3b

7、IgG的制備。利用菊糖能夠從旁路途徑激活補體的特性，使菊糖與新鮮雞血清反應，補體激活過程中生成的補體C3b分子通過共價鍵與菊糖分子形成菊糖-C3b，分離反應液中的菊糖-C3b，用于免疫注射家兔制備抗雞補體C3b血清，并利用ProteinA-SepharoseCL-4B作為層析介質，以親和層析方法從抗C3b血清中分離純化抗C3bIgG。應用間接ELISA方法測定抗C3b血清和IgG的抗體效價。結果表明，制成的抗血清中的抗體ELISA效價達

8、212，從抗血清中提取的IgG的抗體效價達218。 5.雞補體C3b的分離純化。按照說明書，將純化的抗C3bIgG連接于CNBr-activatedsepharose4BFastFlow的活化位點上，制備以抗C3bIgG為配體的親和層析柱，用活化SPF雞血清重復過層析柱，以0.1mol/L氨基乙酸-HCl緩沖液(PH2.8)洗脫，ELISA檢測洗脫液中含有C3b的組分，將分離到的C3b經(jīng)非變性的PAGE電泳檢測，得到單一條帶的電

9、泳圖譜，經(jīng)變性的PAGE-SDS電泳檢測，電泳圖譜上顯示兩條蛋白帶，分別為C3b的α鏈β鏈，表明分離到了純度較高的補體C3b蛋白。 6.雞補體C3b對免疫增強作用的驗證。以戊二醛作為交聯(lián)劑，將分離到的C3b蛋白與大腸桿菌抗原偶聯(lián)，制備成大腸桿菌-C3b抗原復合物；免疫注射SPF雞，對照組雞免疫注射弗氏完全佐劑大腸桿菌疫苗。分別在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血，用ELISA方法測定血清中的抗體含量，同時測定血清中總

10、補體活性。結果表明，免疫后3周，弗氏佐劑大腸桿菌疫苗誘導雞體產生的抗體效價高于C3佐劑疫苗組，但至第4周，弗氏佐劑疫苗組的抗體水平達到高峰(OD值=0.270±0.004)，然后迅速下降，到第九周降至0.200±0.005，而C3疫苗組雞免疫后的抗體水平持續(xù)上升，從免疫后第二周的0.098±0.003上升到第八周的0.275±0.002。證明C3能夠促進免疫記憶細胞的產生，并能夠使細菌抗原給予免疫細胞持續(xù)穩(wěn)定的刺激，從而使雞體維持高水平