PCR在啤酒廠快速鑒定啤酒有害菌的應(yīng)用研究.pdf

1、本文的研究工作主要內(nèi)容分4個(gè)部分： 首先對(duì)啤酒廠啤酒釀造過(guò)程及環(huán)境中有害菌的分布及種類進(jìn)行了研究。在啤酒廠，從麥汁、發(fā)酵液、清酒、儲(chǔ)存酵母、設(shè)備表面、成品啤酒中共分離到112株可在厭氧環(huán)境條件在NBB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌。經(jīng)過(guò)對(duì)這112株細(xì)菌對(duì)啤酒的腐敗試驗(yàn)，確定其中44株為啤酒有害菌。通過(guò)對(duì)這44株有害菌進(jìn)行梅里埃生理生化鑒定、16srDNA序列分析、產(chǎn)乳酸試驗(yàn)等，得知這44株有害菌分屬于以下2個(gè)屬的8種乳酸菌： Leu

2、conostocpseudomesenteroides、Leuconostoccitreum、Lactobacilluscollinordes、Lactobacillusbrevis、Lactobacillusfructivorans、Lactobacillusparacasei、Lactobacillusplantarum、Lactobacillusacetotolerans。 其次，以細(xì)菌16srDNA為基礎(chǔ)，對(duì)有害菌快速鑒

3、定進(jìn)行了研究。根據(jù)文獻(xiàn)記載以及本研究所確定的有害菌種類，從Genebank中下載有害菌所在屬的63種細(xì)菌的16srDNA序列，用DNAstar軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析，找出這63種細(xì)菌16srDNA序列所共有的5條同源序列，以這5條同源序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出一對(duì)適合所有有害菌的通用引物：上游：5’-GAACAGGATTAGATACCC-3’，下游：5’-GACTTAACCCAACATCTCAC-3’。利用該對(duì)引物，可以檢測(cè)出啤酒廠出現(xiàn)的8種有害菌

4、，而對(duì)啤酒中常出現(xiàn)的13種非有害菌則不能檢出，保證了該引物對(duì)啤酒有害菌的特異性。 以抗酒花基因horA為基礎(chǔ)對(duì)有害菌快速鑒定進(jìn)行了研究。由于啤酒有害菌大多為乳酸菌，根據(jù)文獻(xiàn)研究所得出的結(jié)論：啤酒乳酸菌大多含有抗酒花基因horA，利用以horA基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)的引物L(fēng)bHC-1：5’-ATCCGGCGGTGGCAAATCA-3'和LbHC-2:5'-AATCGCCAATCGTTGGCG-3’對(duì)有害菌進(jìn)行快速鑒定。PCR反應(yīng)條件為：在

5、25μLPCR反應(yīng)體系中，加入濃度為10μM的引物L(fēng)bHC-1和LbHC-2各1μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)3μL，混合ddNTP0.8μL，TaqE(5U/μL)0.4μL，DNA5μL，雙蒸水13.8uL。循環(huán)體系：首輪循環(huán)94℃變性3min，接著以94℃1min，55℃2min，72℃30sec進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1％低瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。凝膠PCR所需時(shí)間總共為4小時(shí)。由于PCR檢測(cè)有害菌存在細(xì)胞檢測(cè)靈敏度

6、問(wèn)題，因此在檢測(cè)之前必須對(duì)啤酒樣品進(jìn)行富集增菌培養(yǎng)，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到可以檢測(cè)出的水平。富集培養(yǎng)是啤酒有害菌快速檢出的門檻及瓶頸，富集培養(yǎng)所需的時(shí)間越短，檢測(cè)所需總時(shí)間就越短，檢測(cè)效率就越高。本研究比較了4種培養(yǎng)基的增菌效果，其中MRS增菌速度最快。對(duì)有害菌培養(yǎng)的最適溫度是30℃。在MRS培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子D-泛酸、菸酸胺、煙酸、葉酸、VB12、生物素、VB6、VB1、核黃素，觀察對(duì)啤酒有害菌增殖的效果。結(jié)果顯示：添加100mg/L葉酸的M

7、RS培養(yǎng)基比不加葉酸的MRS培養(yǎng)基對(duì)8種有害菌株的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)還表明：PCR檢測(cè)有害菌細(xì)胞的靈敏度為3～70個(gè)細(xì)胞(CFU)，而用MRS培養(yǎng)基加100mg/L葉酸對(duì)樣品進(jìn)行富集，可以使一個(gè)有害菌細(xì)胞在培養(yǎng)16小時(shí)后超過(guò)70個(gè)。另外，細(xì)菌質(zhì)粒DNA提取方法對(duì)檢測(cè)時(shí)間及靈敏度的影響也進(jìn)行了研究。在抽提法、煮沸法、凍融法、菌體直接PCR等4種提取方法中，除菌體直接PCR不能檢出有害菌外，抽提法、煮沸法、凍融法都可檢測(cè)出有害菌，且

8、3種方法檢測(cè)的靈敏度一致，但煮沸法較抽提法和凍融法更省時(shí)，更經(jīng)濟(jì)，更環(huán)保。用添加了100mg/L葉酸的MRS培養(yǎng)基增殖細(xì)胞，用煮沸法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)凝膠PCR檢測(cè)，所需時(shí)間總共不超過(guò)24小時(shí)。將凝膠PCR方法應(yīng)用于生產(chǎn)線上的純生啤酒有害菌檢測(cè)，結(jié)果表明：與用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法檢測(cè)相比，結(jié)果的一致率達(dá)到99.7％。凝膠PCR方法比傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法有更高靈敏度。 最后對(duì)可過(guò)濾樣品和不可過(guò)濾樣品的預(yù)處理進(jìn)行了研究。對(duì)于可過(guò)