心血管內(nèi)靶向定位基因遞送體系——載基因支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)是冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病的主要治療手段，但PTCA術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生率高達(dá)15-60％，迄今仍是臨床亟待解決的難題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展為血管再狹窄的基因治療奠定了基礎(chǔ)。心血管內(nèi)基因治療的成功必須依靠有效的治療基因，安全的載體和可以把基因(和載體)遞送到血管內(nèi)靶部位的遞送體系。心血管內(nèi)基因治療的特殊性在于很難把基因?qū)Ｒ恍赃f送到血管組織而不進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。以往的研究大多數(shù)采用球囊導(dǎo)管向血管內(nèi)灌注基因(和

2、載體)，研究表明，灌注到血管內(nèi)的載體大部分隨血流進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)，到達(dá)病灶局部的基因很少，達(dá)不到治療效果。 血管內(nèi)支架攜帶基因有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以在植入支架的同時(shí)將基因遞送到心血管內(nèi)的病灶部位，借助支架與血管壁的緊密接觸，使基因被局部血管組織吸收，隨著基因的緩慢釋放，達(dá)到長(zhǎng)期的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)?；蜉d體分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但安全性方面存在潛在的危險(xiǎn)性。非病毒載體安全性好，易于制備，近年來(lái)倍受關(guān)注。陽(yáng)離子脂

3、質(zhì)體和殼聚糖是目前研究最廣泛的非病毒載體，顯示出了一定的優(yōu)越性。 本課題針對(duì)心血管基因治療的主要技術(shù)難題，采用血管支架為基因遞送平臺(tái)，將抗DNA抗體—質(zhì)粒DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體三元復(fù)合納米基因載體和殼聚糖基因納米粒兩種非病毒載體結(jié)合在支架上，并通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)驗(yàn)證這一新型血管內(nèi)基因遞送體系的有效性和可行性。 1.制備了新型抗DNA抗體—質(zhì)粒DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體三元復(fù)合納米基因載體(DAC)，篩選出了最佳配方，并初步進(jìn)行了細(xì)胞

4、攝取及細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗DNA抗體—質(zhì)粒DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以自組裝為360nm左右的球形粒子，與傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體二元基因載體(DC組)相比，DAC體系對(duì)質(zhì)粒DNA的包封率明顯增加，并且明顯地提高了細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染效率。采用雙重?zé)晒鈽?biāo)記聯(lián)合共聚焦顯微觀察發(fā)現(xiàn)抗DNA抗體可促進(jìn)質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞核。使用膠原對(duì)金屬支架表面進(jìn)行涂層，通過(guò)化學(xué)和免疫雙重偶聯(lián)的方法將上述DAC載體固定化在支架表面。使用放射性同位素分別標(biāo)記

5、抗DNA抗體和質(zhì)粒DNA來(lái)測(cè)定支架結(jié)合量及釋放曲線。用細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一新型基因遞送體系的轉(zhuǎn)基因效果。結(jié)果顯示，支架表面通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的膠原涂層具有很好的均一性和結(jié)合穩(wěn)定性。在膠原表面通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)方法結(jié)合抗DNA抗體的量明顯高于物理吸附組，并且可釋放緩慢達(dá)16天以上。通過(guò)免疫偶聯(lián)進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)粒DNA的量是物理吸附組的兩倍，并緩慢釋放達(dá)13天以上。該新型基因支架遞送體系在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中顯示出高效和局部基因轉(zhuǎn)染的特征，兔頸動(dòng)

6、脈植入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血管壁總細(xì)胞轉(zhuǎn)染率大約2.8％，其中新生內(nèi)膜轉(zhuǎn)染率最高，約7％；中膜次之，約為3％；血管外膜幾乎未有轉(zhuǎn)染。攜帶治療基因iNOS的支架植入豬冠狀動(dòng)脈的實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。 2.制備了十二烷基化殼聚糖-pEGFP-C1基因納米粒并進(jìn)行表征。將納米粒涂布于金屬支架表面，制備了攜帶十二烷基化殼聚糖基因納米粒的支架并進(jìn)行電鏡觀察。將攜帶殼聚糖基因納米粒的支架進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和兔頸動(dòng)脈體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，十二烷基化殼聚糖-pEGF

7、P-C1納米粒為穩(wěn)定的球形，平均粒徑126nm，zeta電位+28±3mV。電鏡下，涂布于支架表面的納米粒呈不規(guī)則片狀分布于支架表面。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用攜帶十二烷基化殼聚糖-pEGFP-C1基因納米粒的支架，顯示出局部轉(zhuǎn)染特征。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用攜帶十二烷基化殼聚糖-pGL3質(zhì)?；蚣{米粒(表達(dá)螢光素酶的質(zhì)粒)的支架，回收支架上黏附的血管組織標(biāo)本勻漿后，測(cè)定有高劑量螢光素酶表達(dá)，而對(duì)照組動(dòng)脈及組織螢光素酶測(cè)定均為陰性，同實(shí)驗(yàn)組支架植入處動(dòng)脈螢光

8、素酶活性比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩只動(dòng)物肝臟標(biāo)本發(fā)現(xiàn)微量螢光素酶表達(dá)。使用十二烷基化殼聚糖基因(偶聯(lián)pEGFP-C1質(zhì)粒)支架，熒光顯微鏡及免疫組織化學(xué)檢查證明新生內(nèi)膜轉(zhuǎn)染率高達(dá)12.3％，中膜外膜未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。 綜上所述，以支架為基礎(chǔ)的非病毒載體基因遞送體系是一種新型有效的血管內(nèi)基因遞送體系。通過(guò)化學(xué)與免疫雙重偶聯(lián)的方法，可有效的將質(zhì)粒DNA結(jié)合在支架表面，在達(dá)到治療目的同時(shí)不出現(xiàn)基因的遠(yuǎn)處播散，是一種有前途的基因遞送體系，可能