HPV主要衣殼蛋白L1基因原核表達系統(tǒng)的構建及尖銳濕疣組織標本中HPV-6-11型感染率和L1基因表達率的研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)是雙鏈DNA病毒，有嚴格的嗜上皮性。由于基因組序列差異，目前發(fā)現(xiàn)HPV有130余基因型。HPV的L1和L2基因分別編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2，兩者組成病毒的蛋白衣殼，其中L1蛋白和L3蛋白組成比例為25～30：1。L1基因全長1.5kb，其表達產(chǎn)物分子量為55～60KD。L1蛋白序列相當保守，是HPV主要種屬特異性抗原，可誘生中和性抗體。 HPV主要感染人

2、類的皮膚和粘膜組織，引起上皮組織增生性疾病。按照HPV不同型別感染后的危害程度，流行病學上將其分為高危、中等及低危三種類型。高危型如HPV-16、HPV-18和HPV-45型等，中間型包括HPV-33、HPV-35和HPV-58型等，高危型和中間型HPV與宮頸癌(cervicalcarcinoma)發(fā)生密切相關。低危型如HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43和HPV-44型等，常導致皮膚尋常疣和生殖器的尖銳濕疣(point

3、edcondyloma)，其中以HPV-6和HPV-11引起尖銳濕疣最為常見。 由于宮頸癌是最為常見的婦科惡性腫瘤，尖銳濕疣是主要性傳播性疾病之一，因而HPV疫苗是近年相關領域的研究熱點。有文獻報道，L1基因表達產(chǎn)物或L1和L2共同表達后組成的病毒樣顆粒(viruslike-particles，VLPs)，均能誘導實驗動物產(chǎn)生保護性免疫應答，但VLPs產(chǎn)量均較低。目前，針對宮頸癌基于HPVL1蛋白的VLP疫苗己進入Ⅲ期臨床試驗，

4、其實際預防效果尚無定論。 目前對HPV感染的實驗室診斷，主要依賴于PCR、Southern雜交等分子生物學技術檢測HPV特異性基因片段。然而，這些方法無法了解患者有無對HPV的免疫應答及其狀態(tài)，有一定比列的假陽性，且費用高昂。眾所周知，血清學技術也是檢測特定病原體感染的主要手段之一。但目前HPV尚無可靠的體外培養(yǎng)方法，也不能在動物體內(nèi)增殖，因而難以獲得血清學檢查所需的HPV抗原。因此，采用基因工程技術，構建HPV主要衣殼蛋白L1

5、基因高效表達系統(tǒng)，從而較為便利地獲得大量目的重組表達產(chǎn)物。利用重組主要衣殼蛋白L1(recombinantL1，rL1)所建立的相關血清學檢測方法，不僅可用于尖銳濕疣的臨床實驗室診斷，也可作為HPV感染和宮頸癌及其癌前病變血清流行病學調(diào)查的重要手段。然而，目前尚無文獻報道HPV相關疾病的血清學檢測方法。 本研究建立了基于L1基因的可同時檢測HPV-6和HPV-11的雙重PCR，以了解我國尖銳濕疣患者組織標本中HPV-6和HPV-

6、11感染率的差異；從尖銳濕疣患者病變組織中克隆了HPV-6的全長L1基因并構建了其高效原核表達系統(tǒng)，建立了ELISA檢測標本中HPVL1基因表達情況，為rL1作為實驗室診斷乃至疫苗的候選抗原提供依據(jù)。 材料和方法 1.DNA模板的制備： 尖銳濕疣組織標本充分剪切研磨后，部分用于L1蛋白的ELISA測定，其余用上海博彩生物科技有限公司(Biocolor)GenomicDNAPurificationKit提取DNA，

7、并用紫外分光光度法測定DNA濃度和純度。 2.目的基因的擴增： 根據(jù)報道的HPV-6型L1基因(GenbankNo.：NC001668、AF067036、AF092932)的核苷酸序列和內(nèi)切酶圖譜分析結果，設計含合適內(nèi)切酶位點的引物。采用PCR擴增尖銳濕疣組織標本中的目的基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。 3.T-A克隆、測序與表達載體的構建： 采用上海博亞生物科技有限公司(BioAsia)的T-A克隆試

8、劑盒將擴增的目的片段克隆至pGEM-T載體中，轉化于E.coliDH5α株并增菌，堿變性法提取重組質粒。獲得滿意的測序結果后，分別將含pGEM-T-L1和pET32a的E.coliDH5α菌株增菌，提取質粒后用雙酶切獲得的目的基因片段與線性pET32a，兩者連接后轉化于E.coliBL21DE3，增菌、提取重組質粒后再次測序，并與上述報道的HPV-6型L1基因序列進行同源性比較。 4.目的重組蛋白表達與純化： L1基因原

9、核表達系統(tǒng)pET32a-L1-E.coliBL21DE3用不同濃度IPTG37℃誘導表達4h，用10％SDS-PAGE檢查目的重組蛋白rL1的表達情況。采用Ni-NTA(BioAsia)親和層析法收集表達的rL1。 5.rL1抗血清制備及其效價測定 常規(guī)家兔皮下免疫法制備rL1抗血清，采用免疫雙擴散試驗確定rL1抗血清的效價。 6.臨床標本中L1基因表達情況的檢測 116例患者尖銳濕疣組織標本勻漿后超聲破

10、碎(300V,5S×3)，3000r/min離心10min后取上清，用紫外分光光度法測定其蛋白濃度。用蛋白含量為100μg/ml的尖銳濕疣組織超聲破碎物上清為包被抗原，1∶500稀釋的兔抗L1血清為一抗、1∶3000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG(JacksonImmunoResearch)為二抗，建立ELISA檢測上述尖銳濕疣組織標本中L1蛋白。實驗中同時用5份相同蛋白含量的手術切除包皮超聲破碎物上清和rL1分別為陰性和陽性對照。以OP

11、T為底物，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各標本的OD490值，以5份陰性對照OD490均值加3SD為陽性判斷標準。 7.尖銳濕疵標本中HPV-6/11型感染率的檢測 根據(jù)HPV-6型L1基因(GenbankN0.：NC001668、AF067036、AF092932)第130位缺失、第131位為絲氨酸，HPV-11型L1基因(GenbankNo.：U55993、M14119)氨基酸序列第130和131位分別為甘氨酸和酪氨酸；以及H

12、PV-6和11型273-278氨基酸序列分別為IIKGSG和LVKGGN，采用PrimerDesigner軟件設計HPV-6和11型的特異性引物各一對，建立可同時檢測HPV-6和HPV-11型L1基因的雙重PCR。采用該雙重PCR，檢測116例患者尖銳濕疣組織標本中HPV-6和HPV-11型L1基因片段。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，HPV-6和HPV-11型L1基因擴增產(chǎn)物的預期大小分別為305bp和444bp。 結果

13、 1.目的基因的PCR擴增結果： 從編號H26尖銳濕疣組織DNA標本中，擴增獲得大小為1503bp的全長HPV-6L1基因片段。 2.目的基因克隆序列分析結果： 與報道的HPV-6L1基因序列比較，所克隆的全長HPV-6L1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.20～99.93％和99.80～100％，T-A克隆和亞克隆序列完全相同。 3.rL1表達及其抗血清效價： 1.0、0.5、0.1mm

14、ol/LIPTG均能誘導rL1表達，但以0.1mmol/LIPTG誘導效果較好。rL1兔抗血清免疫雙擴散效價為1：4。 4.尖銳濕疣標本中L1蛋白的檢測結果： 5例陰性對照OD490均值±SD的值為0.17±0.06，故陽性判斷標準為0.35。按上述判斷標準，88.8％尖銳濕疣組織標本(103/116)的L1蛋白檢測結果陽性，其OD490值范圍為0.46～1.15。其中4例PCR結果陽性但ELISA結果陰性，未發(fā)現(xiàn)PCR

15、結果陰性而ELISA結果陽性者。 5.尖銳濕疵標本中HPV11/6型的感染率： 116例患者尖銳濕疣組織標本中，HPV-6和HPV-11L1基因檢測總陽性率為92.2％(107/116)。其中75例HPV-6L1基因檢測結果陽性，25例HPV-11L1基因檢測結果陽性，7例HPV-6和HPV-11L1基因檢測結果均陽性。 結論 1.本研究成功地構建了HPV-6型L1基因高效原核表達系統(tǒng)； 2.建立