肝細(xì)胞生長因子轉(zhuǎn)染的MSCs防治小鼠腸道移植物抗宿主病及其機(jī)理研究.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植是治療惡性血液病最有效的方法之一，但是，由于供受者之間主要組織相容性復(fù)合體的不同，移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生難以完全避免。GVHD可以影響多個器官，主要是皮膚、肝臟和腸道。重度腸道GVHD會加重全身GVHD，影響移植的療效，增加病死率。腸道粘膜損傷能夠通過加重GVHD時的炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴，因此，粘膜損傷修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)是腸道GVHD治療的關(guān)鍵。 肝細(xì)胞生長因子(HGF)對許多組織都具有修復(fù)作用，間充質(zhì)干細(xì)

2、胞(MSCs)不僅具有損傷修復(fù)作用，還具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)造血恢復(fù)的作用，本實(shí)驗(yàn)建立小鼠異基因造血干細(xì)胞移植腸道GVHD模型；應(yīng)用高表達(dá)HGF的MSCs(MSC-HGF)防治小鼠腸道GVHD，比較其與藥物以及單獨(dú)應(yīng)用MSC防治GVHD之間的差異。 材料和方法:Balb／c小鼠經(jīng)5．5Gy照射后輸注C57BL／6小鼠骨髓細(xì)胞及脾細(xì)胞建立小鼠腸道GVHD模型；分離培養(yǎng)、鑒定C57BL／6小鼠骨髓MSCs，應(yīng)用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pcDNA3

3、．1一HGF瞬時轉(zhuǎn)染入MSCs，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞HGF表達(dá)情況；實(shí)驗(yàn)組根據(jù)細(xì)胞輸注時間(Od，+6d，+10d)和輸注形式(MSC或MSC-HGF)的不同分為6組：MSCs-0d，MSC-HGF-0d，MSCs-6d，MSC-HGF-6d，MSCs-10d，MSC-HGF一10d；輸注MSCs細(xì)胞數(shù)量為1×106／只；空白對照組未予GVHD預(yù)防與治療，藥物對照組采用環(huán)胞菌素(CSA，5mg/kg/d，灌胃)和驍悉(MMF，40mg／kg／d

4、，灌胃)聯(lián)合防治GVHD。比較移植后腸道GVHD的發(fā)生率和致死率，腸道病理損傷情況以及小鼠存活情況。檢測細(xì)胞輸注后受體小鼠T細(xì)胞亞群變化，CD4+CD25+T細(xì)胞比例變化，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況，以及腸道凋亡細(xì)胞變化。 結(jié)果:Balb／c小鼠經(jīng)5．5Gy照射后，輸注C57BL／6小鼠脾細(xì)胞(5×109只)和骨髓細(xì)胞(2×lO7／只)能夠獲得供者成分的植入，在移植后一周逐漸出現(xiàn)GVHD癥狀，經(jīng)病理檢測，腸道GVHD發(fā)生率為100

5、％，死亡率為100％，存活時間為13±1．6天；建立的腸道GVHD模型穩(wěn)定、且癥狀典型，適用于腸道GVHD防治研究。 體外培養(yǎng)的小鼠MSC具有典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，檢測MSCs表型CD44：87．9％，CD29-98．5％，CD34：1．22％，CD45：1．28％，CDl05：65％，Sca-1：70．1％，經(jīng)特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)可向成脂和成骨方向分化。MSCs高表達(dá)IL-6，IL-10，TGF-βl，弱表達(dá)IL-2R，未檢出IL

6、-2、IL-4、IFN-y；應(yīng)用pcDNA3．1．HGF轉(zhuǎn)染MSCs后，除HGF表達(dá)增高外，各炎性相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)未見改變。轉(zhuǎn)染試劑對MSC的活性無影響，轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)及定向分化特性未發(fā)生改變；HGF在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到最高表達(dá)量，隨時間推移逐漸減低，在+10d時仍略高于對照。 移植后各組小鼠白細(xì)胞在+3d、+4d降至最低值，于+6d恢復(fù)造血；在移植后+3d和+4d時，Od輸注細(xì)胞組白細(xì)胞數(shù)值明顯高于其它各組，具有顯著差異(P<0

7、．05)。藥物對照組10％小鼠在造血恢復(fù)前死亡，推測與藥物的急性毒性反應(yīng)有關(guān)，其余小鼠出現(xiàn)腸道GVHD的時間約在+lOd左右，死亡率為100％，平均存活時間為14i6．1d，與空白對照組相比無顯著性差異(P>0．05)。Od輸注細(xì)胞組腸道GVHD發(fā)生率均為90％，致死率為100％，MSC-HGF-0d組存活時間(22+3．9天)較MSC-0d組(184-5．9天)延長；+6d和+lOd輸注細(xì)胞組在移植后獲得較低的腸道GVHD發(fā)病率，腸道

8、GVHD致死率也明顯低于其他組，+6d輸注MSCs或MSC-HGF未見明顯療效差異，+lOd輸注MSC-HGF療效好于單獨(dú)應(yīng)用MSCs，表現(xiàn)為病理損傷減輕和存活時間的延長。 MSCs輸注后能夠植入受者體內(nèi)，并發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用。表現(xiàn)為移植后CD3+T細(xì)胞恢復(fù)快，CD4+／CD8+T細(xì)胞比值接近正常水平，較對照組的比例倒置有顯著差異(P<0．05)；CD4+CD25+T細(xì)胞比例增加；輸注MSCs組小鼠從移植后+21d開始檢測到

9、Th2類細(xì)胞因子表達(dá)量升高，輸注MSC-HGF組小鼠腸道HGF表達(dá)量高于單獨(dú)輸注MSCs，腸道粘膜上皮凋亡細(xì)胞比例較對照組顯著減少。 結(jié)論:實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定典型的小鼠腸道GVHD模型；成功分離培養(yǎng)小鼠骨髓MSCs，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染MSCs使其瞬時高表達(dá)HGF，應(yīng)用HGF轉(zhuǎn)染的MSC防治小鼠腸道GVHD取得一定療效，證明從免疫調(diào)節(jié)和粘膜損傷修復(fù)這一角度治療腸道GVHD是可行的；對輸注時機(jī)的比較為臨床應(yīng)用MSCs提供了參考，認(rèn)為M