小檗堿改善能量代謝的作用及機制研究.pdf

1、目前，從天然藥物中挖掘和尋找新的針對胰島素抵抗和2型糖尿病的藥物已成為國內(nèi)外的研究熱點。中藥黃連是祖國醫(yī)學(xué)中用于治療糖尿病的常用藥物，小檗堿是黃連中含量最為豐富的單體成份。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗的發(fā)生與線粒體功能障礙密切相關(guān)，胰島素抵抗的小鼠、2型糖尿病動物和患者均伴有骨骼肌、肝臟和脂肪組織中線粒體氧化磷酸化活性下降、ATP生成減少、線粒體功能障礙。但到目前為止，對小檗堿與能量代謝及線粒體的關(guān)系尚未完全闡明。為了明確小檗堿對能量

2、代謝的作用，本文在整體動物水平研究了小檗堿對機體能量代謝的影響，并結(jié)合分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究方法，初步探討了其作用機制和靶點。
　　 目的：研究小檗堿對線粒體功能及能量代謝的影響，并探尋其作用的分子機制。
　　 方法：①應(yīng)用db/db小鼠觀察小檗堿處理后對其血糖、血脂及相關(guān)代謝指標(biāo)的改善作用。利用IPGTT（腹腔注射糖耐量實驗）、ITT（胰島素耐量實驗）和PTT（丙酮酸耐量實驗）評估小鼠糖耐量和胰島素敏感性的變化；記

3、錄給藥期間小鼠體重曲線和體溫的變化；檢測肌肉和肝臟中甘油三酯的沉積情況；利用電鏡和線粒體拷貝數(shù)觀察和檢測小檗堿處理后db/db小鼠棕色脂肪組織、白色脂肪組織和骨骼肌中線粒體的變化；HE染色和免疫熒光染色觀察棕色脂肪組織、白色脂肪組織形態(tài)的變化和UCP1的表達情況；利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）和Western blot檢測與線粒體生成、脂肪酸氧化以及重要轉(zhuǎn)錄因子和激酶等相關(guān)基因mRNA和蛋白表達水平和活性的變化。②

4、小檗堿處理C2C12骨骼肌細(xì)胞，利用Mito-Tracker Green染色觀察線粒體MASS的變化，并用檸檬酸合酶實驗檢測其功能，Real -time PCR及Western blot方法檢測與線粒體功能和能量代謝相關(guān)基因mRNA和蛋白的變化。應(yīng)用熒光素酶報告基因?qū)嶒?、RNA干擾、點突變等技術(shù)作進一步機制探討。
　　 結(jié)果：⑴小檗堿處理后能顯著降低db/db小鼠的體重和血糖、使其體溫升高，明顯改善db/db小鼠的糖耐量，提高其

5、胰島素敏感性；⑵小檗堿處理后能顯著降低db/db小鼠的體脂含量，脂肪細(xì)胞形狀變??；明顯改善外周組織如肝臟和肌肉組織的脂質(zhì)沉積；⑶小檗堿能夠顯著增加db/db小鼠棕色脂肪、白色脂肪及骨骼肌組織線粒體數(shù)目；⑷小檗堿促進db/db小鼠棕色脂肪、白色脂肪及骨骼肌組織與能量代謝及線粒體相關(guān)的基因mRNA水平和蛋白表達；⑸小檗堿可促進白色脂肪組織中UCP1的表達；⑹小檗堿可以增加C2C12細(xì)胞中線粒體數(shù)目和活性，促進調(diào)節(jié)能量代謝及線粒體生成和活性相

6、關(guān)的基因mRNA水平和蛋白表達，如PGC-1α等重要轉(zhuǎn)錄因子都在小檗堿處理后顯著升高；⑺小檗堿處理后可顯著促進C2C12骨骼肌細(xì)胞SIRT1的活性。
　　 結(jié)論：小檗堿能顯著改善肥胖小鼠的胰島素抵抗，促進與能量消耗相關(guān)的重要基因mRNA和蛋白水平的升高，能夠增加棕色脂肪，白色脂肪以及肌肉組織中的線粒體的數(shù)目，促進白色脂肪組織的棕色化；本論文還初步證明了小檗堿改善能量代謝的作用可能是通過SIRT1-PGC-1α這一信號通路來實現(xiàn)。