雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)頂膜抗原AMA1蛋白親和肽篩選及其抗球蟲(chóng)作用研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的病原體之一，導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大。盡管飼料添加藥物的方式對(duì)球蟲(chóng)病的防控發(fā)揮了重要的保障作用，但隨著雞球蟲(chóng)抗藥性、藥物殘留等一系列問(wèn)題的產(chǎn)生，迫切需要尋找新的藥物靶標(biāo)分子從而開(kāi)發(fā)新型藥物。對(duì)瘧原蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)等寄生原蟲(chóng)的研究已經(jīng)表明，頂復(fù)門原蟲(chóng)的項(xiàng)膜抗原1(AMA1)是頗具應(yīng)用前景的藥物靶標(biāo)。瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等在侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中，AMA1發(fā)揮重要作用。但目前關(guān)于雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E.tenella）子孢子頂膜抗原1

2、（EtAMA1）的功能的相關(guān)報(bào)道較少。本研究探索了EtAMA1胞外域重組蛋白(EctoAMA1)親和配體在球蟲(chóng)感染中的抑制作用。
　　1.以純化并復(fù)性的原核重組EctoAMA1蛋白為靶蛋白，利用噬菌體十二肽庫(kù)對(duì)其進(jìn)行四輪生物淘選。從第四輪洗脫物中隨機(jī)選出30個(gè)噬菌體藍(lán)斑，擴(kuò)增后提取其核苷酸序列并測(cè)序，進(jìn)而推導(dǎo)出多肽序列。結(jié)果顯示:對(duì)靶分子進(jìn)行四輪篩選后，得到5種親和力較高的十二肽。選取高親和力的兩條多肽序列進(jìn)行合成，命名為L(zhǎng)肽和C

3、肽，即為L(zhǎng)PSYPGYYQITI(L)和CWTISLFGGVTQ(C)。間接ELISA結(jié)果表明，所合成兩多肽與重組Ecto AMA1蛋白及EtAMA1蛋白均能夠特異性結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果表明，抗EctoAMA1重組蛋白多克隆抗體能夠抑制親和噬菌體與重組EctoAMA1的結(jié)合。
　　2.對(duì)L肽和C肽體外抑制子孢子入侵細(xì)胞能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先用MTT法檢測(cè)L、C兩多肽對(duì)MDBK細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度，確定最大無(wú)毒濃度為125μg/mL。

4、使用pecoll梯度離心法純化E.tenella子孢子，得到較為純凈的E.tenella子孢子，用CFDA-SE熒光探針標(biāo)記純化后的子孢子，利用標(biāo)記有綠色熒光的子孢子（3×105個(gè)/孔）入侵MDBK（鋪板量1×105個(gè)/孔）細(xì)胞10h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)多肽L、C分別在濃度為25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL時(shí)抑制子孢子入侵的作用。結(jié)果表明:L肽及C肽對(duì)子孢子入侵MDBK細(xì)胞均具有一定的抑制作

5、用。在不同濃度梯度下L肽作用均顯著或極顯著高于C肽(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.對(duì)L肽和C肽體內(nèi)抗球蟲(chóng)感染作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。1日齡雛雞40只隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為PBS組、L肽處理組、C肽處理組以及攻蟲(chóng)對(duì)照組。21日齡時(shí)，L組、C組、攻蟲(chóng)對(duì)照組雞每只口服感染1×104個(gè)E.tenella卵囊，在感染后0～2天（子孢子繁殖期），L組口服L肽對(duì)應(yīng)陽(yáng)性噬菌體，每只每天1×1012pfu;C組口服C肽對(duì)應(yīng)噬菌體，每只每天

6、1×1012pfu。攻蟲(chóng)后第8天剖殺全部雞只，檢測(cè)雞增重變化、盲腸病變計(jì)分、盲腸眼觀病變及病理組織病變、OPG及ACI等評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示:L組、C組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著優(yōu)于攻蟲(chóng)對(duì)照組(P＜0.05)，L組與C組相比，L組各項(xiàng)指標(biāo)均稍優(yōu)于C組。PBS組、L組、C組、攻蟲(chóng)對(duì)照組抗球蟲(chóng)指數(shù)分別為200、164.45、153.64、119.45。
　　4.應(yīng)用Swiss-Model軟件對(duì)EtAMA1進(jìn)行三維模建。利用Autodock4.2軟件

7、分別對(duì)L肽與EtAMA1、C肽與EtAMA1進(jìn)行分子對(duì)接分析，研究EtAMA1在空間上與L肽和C肽結(jié)合方式。結(jié)果顯示:同源建模評(píng)分達(dá)90分以上，模型結(jié)果合理可靠。L肽、C肽的氨基酸與EtAMA1活性中心氨基酸間均存在分子間氫鍵作用力與疏水作用力，L、C肽在空間上均能夠與EctoAMA1良好結(jié)合。
　　綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，篩選出的兩個(gè)Ecto AMA1重組蛋白親和配體可以與EtAMA1良好結(jié)合，能夠抑制E.tenella子孢子入侵