RACK1磷酸化MCM7促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖.pdf

1、目的:
　　 RACK1(receptor for activated C kinase1)為有活性的蛋白激酶C受體。蛋白激酶C的激活依賴于RACK1蛋白。RACK1的功能并不局限于PKC通路，作為支架蛋白及適應(yīng)蛋白，通過不同的WD40位點，與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白相互作用，參與細(xì)胞功能調(diào)控。微小染色體維持蛋白復(fù)合體(MCM)為DNA復(fù)制執(zhí)照系統(tǒng)成員之一，在真核細(xì)胞的DNA復(fù)制起始調(diào)控中起重要作用，MCM7為該復(fù)合體的重要成分，并對維持

2、MCM復(fù)合體的螺旋酶活性有重要意義，在控制DNA復(fù)制的過程中起關(guān)鍵作用。
　　 本文在肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系H460及肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中干擾RACK1，或者瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-sport6-RACK1，MTT、集落形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)檢測RACK1在肺癌細(xì)胞中的功能；免疫共沉淀和免疫熒光雙重染色激光共聚焦實驗證實MCM7與RACK1的直接作用，探討可能存在的作用機制。
　　 方法:
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　

3、肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系H460及肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自ATCC。在含有10％胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。
　　 2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與RNAi
　　 用含有10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系H460及肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，接種16～18h后，按照Lipofectamine2000使用說明完成細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染及干擾。
　　 3、Western blot
　　 收集細(xì)胞，提取總蛋白

4、，蛋白定量。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，然后用5％BSA封閉，4℃一抗過夜，二抗37℃孵育2小時后ECL發(fā)光。蛋白條帶經(jīng)BioImaging Systems(UVP,CA，USA)采集后進(jìn)行灰度值測定，目的蛋白灰度值與內(nèi)對照β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后即為其相對蛋白定量。
　　 4、四亞基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細(xì)胞增殖
　　 將轉(zhuǎn)染／干擾后24小時的肺癌細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，分別接種于五個96孔板。分別于第24，48

5、，72，96，120小時加入MTT（5mg/ml）20μl，繼續(xù)孵育4小時后，每孔加入DMSO150μl溶解結(jié)晶，選擇波長490nm在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度。
　　 5、集落形成實驗
　　 將轉(zhuǎn)染／干擾后24小時的肺癌細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，制成300～1000活細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，然后移培養(yǎng)板于CO2培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)10天，用結(jié)晶紫染色觀察并計數(shù)細(xì)胞集落。
　　 6、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期<

6、br>　　 將轉(zhuǎn)染／干擾后48小時的肺癌細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，制成1x107個/ml細(xì)胞懸液，75％乙醇固定過夜、離心后制成500μL的細(xì)胞懸液，加入0.5毫升碘化丙啶(PD染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30min后上機檢測。
　　 7、免疫共沉淀
　　 提取的蛋白裂解液中加入1μg的誘餌蛋白抗體，充分混勻后4℃孵育2小時，再加入40μl protein A/G瓊脂糖珠4℃孵育過夜，按照操作說明，收集免

7、疫沉淀復(fù)合物，行Western blot分析。
　　 8、免疫熒光雙重染色激光共聚焦細(xì)胞內(nèi)共定位
　　 4％多聚甲醛固定1小時，PBS洗2次，10％血清及0.4％Triton X-100 PBS封閉。MCM7單克隆抗體(1:500)、RACK1多克隆抗體(1:500)孵育，4℃過夜。PBS洗2次，?？故蠖?FITC標(biāo)記，1:2000)和羊抗兔二抗(TRITC標(biāo)記，1:2000)室溫孵育1小時。PBS洗2次，DAPI復(fù)染

8、核，PBS洗，封片，共聚焦顯微鏡觀察。
　　 9、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有實驗重復(fù)三次，實驗數(shù)據(jù)用(x)±s表示，采用單因素方差分析利用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 在肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系H460及肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，特異性干擾RACK1后細(xì)胞增殖能力明顯降低，MTT法結(jié)果顯示，細(xì)胞倍增時間明顯減少，集落形成實驗顯示集落生成數(shù)明顯下降，增殖

9、能力降低，流式細(xì)胞術(shù)顯示PI下降，S期比例下降；轉(zhuǎn)染pCMV-sport6-RACK1后細(xì)胞增殖能力升高，細(xì)胞倍增時間增加，集落生成數(shù)升高，S期比例升高。
　　 免疫共沉淀在肺癌細(xì)胞內(nèi)證實兩種蛋白的相互作用，蛋白RACK1能夠在MCM7抗體的免疫復(fù)合物中檢測出來，而在陰性對照IgG中未能檢測出來，同理，蛋白MCM7能夠在RACK1抗體的免疫復(fù)合物中檢測出來，說明MCM7和RACK1可以在細(xì)胞內(nèi)特異性結(jié)合；免疫熒光雙重染色激光共聚

10、焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC-MCM7綠色熒光定位于細(xì)胞核，TRITC-RACK1定位彌散于細(xì)胞漿，在細(xì)胞核中也有點狀表達(dá)，兩者共同定位于細(xì)胞核。進(jìn)一步探討RACK1對MCM7功能的影響，在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549干擾RACK1或瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-sport6-RACK1后，MCM7的蛋白表達(dá)量沒有明顯變化；MCM7沉淀復(fù)合物，抗磷酸化絲氨酸及蘇氨酸抗體檢測的結(jié)果表明RACK1在絲氨酸位點及蘇氨酸位點磷酸化MCM7。
　　 結(jié)論: