表達(dá)肝細(xì)胞生長因子的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)大鼠小肝移植物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分 含人肝細(xì)胞生長因子基因的腺病毒載體的構(gòu)建及病毒體外感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 目的：構(gòu)建含人全長肝細(xì)胞生長因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因與綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因融合的腺病毒表達(dá)載體pDC316-HGF-IRES-EGFP，經(jīng)293細(xì)胞包裝，同源重組產(chǎn)生重組腺病毒Ad-HGF。病毒液感染骨髓間

2、充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)，研究病毒感染效率，以及hHGF基因在BM-MSCs中表達(dá)情況。 方法：將人全長HGF cDNA亞克隆入腺病毒質(zhì)粒載體pDC316-IRES-EGFP-Lacza，建立含hHGF基因的腺病毒表達(dá)載體pDC316-HGF-IRES-EGFP，采用酶切法、PCR法和測序法分別鑒定。采用同源重組法獲得含hHGF的重組腺病毒Ad5-HGF-

3、IRES-EGFP(簡寫為Ad-HGF)。用Csel密度梯度超離心法純化病毒，用空斑形成試驗(yàn)進(jìn)行病毒滴度測定。體外分離、培養(yǎng)BM-MSCs。以僅表達(dá)GFP基因的重組腺病毒Ad5-IRES-EGFP(簡寫為Ad-GFP)為對(duì)照，體外分別感染MSCs。熒光顯微鏡下觀察MSCs有無GFP基因表達(dá)；用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(Fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS)檢測受染細(xì)胞的GFP標(biāo)記以判定HGF表達(dá)。酶聯(lián)

4、免疫吸附測定法(Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)上清hHGF表達(dá)的濃度和持續(xù)時(shí)間。感染Ad-HGF，Ad-GFP的MSCs細(xì)胞分別命名為HGF/MSCs，GFP/MSCs。 結(jié)果：腺病毒表達(dá)載體pDC316-HGF-IRES-EGFP經(jīng)限制性內(nèi)切酶切電泳后顯示有2.3kb的hHGF目的基因片段和5.2kb的線性化pDC316-IRES-EGFP載體片段，顯示構(gòu)建的腺病

5、毒表達(dá)載體中含有hHGF基因；目的片段測序結(jié)果與Gene bank中hHGF cDNA序列一致。經(jīng)293包裝所產(chǎn)生病毒Ad-HGF，純化后滴度可以達(dá)到5.0×10<'11>pfu/mL。熒光顯微鏡下觀察到HGF/MSCs，GFP/MSCs細(xì)胞都有GFP基因表達(dá)。HGF/MSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清中hHGF水平升高，能持續(xù)表達(dá)hHGF大約14天；最高濃度達(dá)到103 ng/mL。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)中腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建正確；重組腺病毒液Ad-H

6、GF滴度高；轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs后在MSCs中獲得高效、穩(wěn)定和持續(xù)表達(dá)的hHGF。該載體達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，為其在進(jìn)一步的體內(nèi)、外研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 第二部分 HGF/MSCs促進(jìn)小移植肝再生的實(shí)驗(yàn)研究 目的:建立大鼠原位30％小體積肝移植模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步了解大鼠行同種原位減體積肝移植后，經(jīng)門靜脈輸注表達(dá)hHGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(HGF/MSCs)，研究其對(duì)移植后小移植肝的保護(hù)作用。 方法：(1)采用Lewis

7、大鼠，改良“二袖套法”建立大鼠30％肝移植模型，分別稱取受體肝臟重量及供肝重量。術(shù)后1，3，5，7天處死大鼠，稱取肝臟重量并取肝組織行組織學(xué)檢查，了解移植后肝臟再生的初步情況。(2)在模型建立的基礎(chǔ)上，將受體分為4組，每組5只，實(shí)驗(yàn)組在供肝植入、門靜脈開放后，立即經(jīng)門靜脈輸注5×10<'6> HGF/MSCs。對(duì)照組則分別輸注相同體積的生理鹽水，5×10<'6> GFP/MSCs，或1.0×10<'9>pfu Ad-HGF(以上都定容至

8、1mL)。分別于術(shù)后1，3，5，7天在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中各隨機(jī)抽取5只大鼠處死。取血檢測血清ALT。記錄移植物濕重。取肝組織用免疫組化法檢測肝細(xì)胞凋亡和增殖活性，或行相關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：(1)對(duì)照組大鼠30％肝移植模型7天存活率33.3％。而實(shí)驗(yàn)組大鼠生存率為73.3％；(2)對(duì)照組移植物組織學(xué)檢查示術(shù)后1天中央靜脈以及肝竇擴(kuò)張、部分肝細(xì)胞增大氣球樣變，3天和5天組可見匯管區(qū)單核細(xì)胞浸潤多；而實(shí)驗(yàn)組肝臟結(jié)構(gòu)損傷輕，炎性細(xì)

9、胞浸潤少，二倍體和多倍體肝細(xì)胞多見；(3)HGF/MSCs輸注的大鼠在術(shù)后3天和5天時(shí)血ALT水平較對(duì)照組明顯降低；(4)實(shí)驗(yàn)組移植物濕重在術(shù)后3天和5天時(shí)較對(duì)照組明顯增加；(5)術(shù)后3天和5天實(shí)驗(yàn)組大鼠的肝移植物增殖和凋亡細(xì)胞明顯較對(duì)照組高；(6)實(shí)驗(yàn)組大鼠28天生存率較對(duì)照組高，且移植肝肝纖維化發(fā)生率低。 結(jié)論：(1)大鼠原位部分肝移植是研究肝再生的良好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，移植肝仍具有良好的增殖活性?2)大鼠部分肝移植后，輸注HGF