原位肝移植（OLT）前后HBV多聚酶（P）區(qū)準(zhǔn)種演變與其克隆型序列分析的研究.pdf

1、目前,全球大約有3億5千萬(wàn)人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV),約5﹪左右最終發(fā)展為肝炎后肝硬化,每年因HBV感染而死亡的人數(shù)近1百萬(wàn).而中國(guó)HBV感染人群比例則更多,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)在10﹪~20﹪之間.目前治療乙型肝炎相關(guān)性終末期肝病最有效的方法仍是原位肝移植(orthotopic liver transplantation , OLT).然而,如果不采取一定的預(yù)防措施,移植后乙型肝炎的復(fù)發(fā)率高達(dá)80﹪以上

2、,可導(dǎo)致移植肝功能衰竭,或需再次肝移植甚至受體死亡.HBV的再感染已成為乙型肝炎相關(guān)性肝病OLT后移植肝功能喪失(liver dysfunction)的主要原因,如何防治肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā),已成為目前急待解決的問(wèn)題.盡管乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)及核苷類似物如拉米夫定(lamuvidine, LMV)等抗病毒制劑的推廣應(yīng)用,而且新的抗病毒藥物還在不斷出現(xiàn),但相應(yīng)的HBV耐藥性突變株仍不斷有報(bào)道,再感染仍未得到有效控制,并直接影響到

3、移植肝的長(zhǎng)期存活.研究發(fā)現(xiàn),HBIg耐藥性突變株主要與病毒S基因區(qū)有關(guān), LMV則主要導(dǎo)致HBV多聚酶(P)區(qū)YMDD基序變異.P區(qū)被認(rèn)為是核苷類似物類藥的作用靶位,但S基因區(qū)與其完全重疊,P區(qū)突變亦會(huì)反映在S基因變異上.準(zhǔn)種(quasispecies)是由Eigen首先提出的用于描述同種生物遺傳異質(zhì)性的概念.在病毒學(xué)研究領(lǐng)域,準(zhǔn)種被用于表示感染個(gè)體內(nèi)同種病毒的遺傳異質(zhì)性(heterogeneity).同人類免疫缺陷病毒(HIV),HB

4、V復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的易錯(cuò)配(error-prone)及多種可能的選擇性壓力作用如免疫制劑與抗病毒藥物等使感染個(gè)體內(nèi)的HBV種群具有明顯的準(zhǔn)種特性及基因異質(zhì)性.HBV準(zhǔn)種特性在慢性乙型肝炎患者中已得到證實(shí).而迄今,尚無(wú)有關(guān)肝移植前后HBV準(zhǔn)種演變報(bào)道.基于上述背景,我們以O(shè)LT后HBV再感染者為研究對(duì)象.首先,篩選中國(guó)近年來(lái)LMV應(yīng)用于OLT后HBV再感染的發(fā)生概貌、相關(guān)易感因素及新一代核苷類似物阿德弗韋(adefovir,ADV)用于LM

5、V耐藥性病例的抗病毒療效.其次,采用高保真的DNA聚合酶及結(jié)合SSCP/HD分析的核酸長(zhǎng)度要求,PCR擴(kuò)增7例再感染HBV基因組逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)B~D區(qū)460bp產(chǎn)物;TA克隆后,以SSCP/HD分析篩選準(zhǔn)種的克隆型,并進(jìn)行優(yōu)劣勢(shì)克隆型核酸序列分析.通過(guò)核酸與氨基酸序列對(duì)照分析,了解肝移植前后HBV聚合酶區(qū)準(zhǔn)種的的分布、組成及其演化.最后,針對(duì)兩例ADV治療無(wú)效的患者,對(duì)服藥前后與核苷類似物類藥耐藥有關(guān)的HBV基因組整個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)

6、 A~E區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,隨機(jī)10個(gè)克隆測(cè)定DNA序列,力求及時(shí)了解有無(wú)可疑的耐藥性變異株出現(xiàn).該研究旨在明確肝移植前后HBV再感染者體內(nèi)病毒代表性準(zhǔn)種的組成及演變,為肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)的發(fā)病機(jī)理,抗病毒治療,以及針對(duì)各種逃逸株的疫苗研制等提供一定的理論依據(jù).主要研究結(jié)果如下:1. 該組肝移植患者中83.3﹪(85/102)為HBV感染的相關(guān)性肝病,提示此類患者是該地區(qū)肝移植的主要對(duì)象;雖然大多采取了預(yù)防性治療措施,而肝移植后HBV

7、再感染仍較為嚴(yán)重,占隨訪期間病例的27.0﹪(17/63);隨著肝移植時(shí)間延長(zhǎng),再感染率亦上升.術(shù)前血清HBV DNA陽(yáng)性及有LMV耐藥性病毒株者更易發(fā)生術(shù)后再感染(P<0.05).ADV對(duì)多數(shù)LMV耐藥性病例的治療有效,但有少數(shù)患者無(wú)效.術(shù)后各時(shí)間段HBV再感染率分別是:半年內(nèi)9.5﹪,半年~1年 13.2﹪,1~2年 27.8﹪,2~3年 41.2﹪,3年以上 60.0﹪.多因素統(tǒng)計(jì)分析顯示,術(shù)前血清HBV DNA陽(yáng)性與服用LMV時(shí)

8、間均與HBV再感染呈正相關(guān)(P<0.05).8例服用ADV患者均在服藥1個(gè)月后血清HBV DNA載量均出現(xiàn)不同程度的下降,除1病例J服藥時(shí)間還不足2個(gè)月外,其余7例有5例在服藥2個(gè)月后HBV DNA降至0 copy/ml.其中有2例出現(xiàn)對(duì)ADV抗病毒治療無(wú)效.1例出現(xiàn)HBsAg/抗-HBs的血清學(xué)轉(zhuǎn)換.2. SSCP/HD分析結(jié)合核酸序列分析可迅速、準(zhǔn)確地分析準(zhǔn)種復(fù)雜性及基因差異性(diversity).肝移植前HBV P區(qū)準(zhǔn)種有10~

9、13種克隆型,HBV再感染后其克隆型有不同程度的下降,為4~8種克隆型,統(tǒng)計(jì)分析準(zhǔn)種復(fù)雜性有顯著差異性(t=6.379,P<0.01).進(jìn)一步的序列分析同樣顯示了準(zhǔn)種序列的差異性改變及病毒種群的漂變(shift).證實(shí)了肝移植前后其病毒多聚酶區(qū)有明顯的準(zhǔn)種演變發(fā)生.3. 核酸序列分析在半數(shù)病例中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)可能是共有的HBV RT區(qū)氨基酸序列變異組合及不明功能的變異體,個(gè)別位點(diǎn)出現(xiàn)了回復(fù)性突變.P基因區(qū)突變亦伴有S區(qū)氨基酸序列變異.術(shù)前已

10、接受LMV治療半年以上的患者均有耐藥病毒株存在.雖然采取了LMV防治措施,但接受抗-Hbe及抗-HBc陽(yáng)性的供體肝仍是不安全的.優(yōu)劣勢(shì)克隆型P區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn),6例中有2例(33.3﹪)出現(xiàn)ntG531→A,相應(yīng)的氨基酸替換為rtD134N;以及ntA669→T、rtM180L的回復(fù)性突變.其他均為單個(gè)病例的改變,如ntA495→T、rtF122I,ntA532→T、rtT135S,ntG741→A、rtV204I/M.而另外兩例的突變n

11、tT638→A并未導(dǎo)致氨基酸基序的變化,屬無(wú)意突變.術(shù)前服用LMV 1~2年左右的病例E、K、N、P在術(shù)前即存在不同的耐LMV突變組合.而分析S區(qū)序列顯示多個(gè)序列存在sM213I.病例P接受了血清抗-Hbe及抗-HBc陽(yáng)性的供體肝,經(jīng)準(zhǔn)種篩選及克隆型序列分析發(fā)現(xiàn),手術(shù)前后核酸序列間同源性相差甚遠(yuǎn),最高在8﹪以上,考慮其手術(shù)前后為不同基因型的病毒株感染,術(shù)后感染病毒可能來(lái)源于供體肝.4. ADV對(duì)多數(shù)LMV耐藥的再感染者有效,但亦有ADV

12、無(wú)效病例出現(xiàn);雖然序列分析未發(fā)現(xiàn)目前已證實(shí)的與ADV耐藥性變異rtN236T,但有多個(gè)目前未報(bào)道的氨基酸替換位點(diǎn);HBV RT的B區(qū)rtL180M替換可能亦影響ADV的抗病毒療效.因此認(rèn)為,ADV耐藥性變異可能亦存在于rt236以外的位點(diǎn).通過(guò)對(duì)ADV無(wú)效的兩病例的病毒RT區(qū)隨機(jī)10克隆序列分析顯示:服藥前后對(duì)比并未發(fā)現(xiàn)rtN236T變異體,僅在個(gè)別克隆(1/10)出現(xiàn)了點(diǎn)突變.病例K的rtL66P、rtI169V、rtY252C及rt

13、M271K,病例N的rtL82P、rtT128M及rtM204S.與服藥有效病例相比,治療無(wú)效的兩病例服藥前均伴有rtL180M變異體,并且出現(xiàn)了rtL180M +rtM204I +rtS213T及rtS135T+rtL180M+rtM204V氨基酸替換組合.結(jié)論:肝移植后HBV再感染仍較突出,隨著肝移植時(shí)間延長(zhǎng),再感染率亦上升.術(shù)前血清HBV DNA存在易導(dǎo)致術(shù)后病毒的再感染;已接受LMV治療半年以上的患者多有耐藥病毒株存在,術(shù)后繼續(xù)

14、應(yīng)用LMV預(yù)防再感染勢(shì)必?zé)o效;長(zhǎng)期單獨(dú)應(yīng)用LMV預(yù)防HBV再感染并不理想.用SSCP/HD分析結(jié)合核酸序列分析可迅速、準(zhǔn)確地分析準(zhǔn)種復(fù)雜性、基因差異性及種群漂變;肝移植前后其病毒多聚酶區(qū)有明顯的準(zhǔn)種演變發(fā)生.HBV 多聚酶區(qū)準(zhǔn)種氨基酸序列在半數(shù)病例中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)可能是共有的變異組合及不明功能的變異體.接受接受抗-Hbe及抗-HBc陽(yáng)性的供體肝仍是不安全的.ADV對(duì)多數(shù)LMV耐藥的再感染者有效,但亦有ADV無(wú)性病例出現(xiàn);序列分析未發(fā)現(xiàn)目前已