抗帕金森病新藥的發(fā)現(xiàn)與評價.pdf

1、帕金森病是一種錐體外系功能障礙引起的慢性神經(jīng)退行性疾病，病理特征是腦黑質(zhì)致密體部位多巴胺能神經(jīng)元變性，紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)含量顯著減少，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)功能低下而膽堿能神經(jīng)功能相對占優(yōu)勢，從而產(chǎn)生運動障礙。帕金森氏病在60歲以上的人群中的發(fā)病率高達1％。導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元變性的原因迄今不明，目前認為，遺傳、感染、免疫功能異常、衰老、體內(nèi)外的神經(jīng)毒素等因素對帕金森氏病發(fā)病均起一定的作用，而氧化應(yīng)激和線粒體功能受損在帕金森氏病的發(fā)病中

2、有十分重要的作用。 目前已有的抗帕金森病藥物只起改善癥狀的作用，不能延緩疾病的進程，不能預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元的退變，且長期應(yīng)用有嚴重的毒副作用，而且可能惡化疾病，因此急需有效的治療藥物。近年來，帕金森氏病藥物治療由直接補充多巴胺轉(zhuǎn)向多環(huán)節(jié)治療，重點集中于對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用。 第一章：抗帕金森病新藥篩選根據(jù)帕金森病的發(fā)病原因和病理機制 本實驗建立了氧化應(yīng)激相關(guān)的6-OHDA損傷SH-SY5Y細胞保護模型和類神

3、經(jīng)生長因子的小分子活性化合物的篩選模型，這兩個模型分別從不同的作用機制來反應(yīng)藥物的作用。6-OHDA是一種選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元的毒素，此模型可以特異性的篩選出對多巴胺能神經(jīng)元有保護作用的藥物。神經(jīng)生長因子是目前帕金森病最有效的神經(jīng)保護治療劑，但由于其蛋白質(zhì)性質(zhì)，限制了臨床應(yīng)用，此模型可以特異性的篩選出類NGF的小分子化合物。通過對560個黃酮類天然產(chǎn)物的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了三個同時具有較強的抗6-OHDA損傷和促PC12細胞分化作用的化

4、合物。本實驗選取在這兩個模型中活性均最強的化合物DL0705進行下一步的研究。進一步細胞實驗結(jié)果顯示，化合物DL0705能劑量依賴性的減輕6-OHDA致SH-SY5Y細胞的活力下降，減輕6-OHDA致SH-SY5Y的凋亡；能劑量依賴性的減輕6-OHDA致PC12細胞損傷的作用，并有明顯的促進正常和6-OHDA損傷情況下PC12細胞分化和軸突生長的作用。 DL0705的主要成分是黃芩素。黃芩素(黃芩苷元，Baicalein)是從唇

5、形科植物黃芩的干燥根中提取的有效成分之一，具有多種藥理作用，如：抗菌、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、清除氧自由基、抗腫瘤、抗凝、抗血栓形成和保護肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等作用。最近的研究報道黃芩素可以預(yù)防Aβ誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元的損傷，可以預(yù)防6-OHDA和LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷。這些研究結(jié)果提示黃芩素可能是一個有效的治療神經(jīng)退行性疾病的化合物，為了探討DL0705在帕金森病中的應(yīng)用前景，本研究進一步采用三種不同的帕金森病動物模

6、型，從動物行為學(xué)、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量、多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目、氧化損傷等方面，對DL0705作為神經(jīng)元保護藥物用于抗實驗性帕金森病的作用及機制進行探討。 第二章：DL0705對小鼠MPTP帕金森病模型的作用及機制研究 本章采用C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP建立亞急性帕金森病動物模型，通過檢測小鼠的行為學(xué)特征，黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目和紋狀體中的單胺類遞質(zhì)的變化來評價DL0705對帕金森病小鼠的影響，同時通過檢測氨基酸類神經(jīng)

7、遞質(zhì)，MPTP損傷通路中的多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)，膠質(zhì)源性纖維蛋白(GFAP)，單胺氧化酶(MAO-B)，乙酰膽堿酯酶(AchE)和氧化應(yīng)激等多種相關(guān)指標來探討DL0705可能的作用機制。 結(jié)果顯示，DL0705可顯著改善MPTP所致的小鼠自發(fā)活動下降(P＜0.05)，縮短MPTP所致的小鼠爬桿時間延長(P＜0.05)；DL0705可顯著預(yù)防MPTP所致的多巴胺類遞質(zhì)DA和HVA下降(P＜0.01)，預(yù)防5-羥色胺和腎上腺素類遞

8、質(zhì)含量下降(P＜0.05)，而對氨基酸類遞質(zhì)的影響不大(P＞0.05)；DL0705可使TH陽性神經(jīng)元數(shù)目和多巴胺轉(zhuǎn)運體數(shù)目增加20％左右；DL0705可抑制炎癥反應(yīng)，如顯著抑制星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生(P＜0.01)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，如顯著降低脂質(zhì)過氧化水平(P＜0.05)，增強腦組織中抗氧化酶GSH-Px的活性(P＜0.05)，可顯著降低一氧化氮水平(P＜0.05)，有降低MPO活性的趨勢，從而起到保護多巴胺能神經(jīng)元的作用。比較DL

9、0705和美多芭在此模型中的作用，結(jié)果顯示DL0705與美多芭作用特點不同，DL0705不僅對多巴胺類遞質(zhì)產(chǎn)生影響，而且對5-HT和腎上腺素類遞質(zhì)也產(chǎn)生影響；除此之外，DL0705的抗氧化作用也在帕金森病中起了重要的作用。 第三章：DL0705對6-OHDA偏側(cè)損傷致帕金森病大鼠模型的作用及機制研究 本章采用6-OHDA前腦內(nèi)側(cè)束兩點定位注射法建立偏側(cè)帕金森病大鼠模型，造模后2周，通過檢測阿樸嗎啡誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為，選取

10、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥240轉(zhuǎn)/40min的大鼠作為造模成功的大鼠。然后隨機分組進行藥物治療，分別在給藥后1周、2周和3周檢測大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，在給藥3周后同時進行自發(fā)活動和肌電測定，通過單胺類遞質(zhì)的變化和多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目多少來評價DL0705在體內(nèi)的活性和藥效。然后通過檢測氨基酸類遞質(zhì)含量，多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)，膠質(zhì)源性纖維蛋白(GFAP)，單胺氧化酶(MAO-B)，乙酰膽堿酯酶(AchE)和氧化應(yīng)激等多種相關(guān)指標來探討DL0705可能作用的機

11、制。 結(jié)果顯示，造模兩周后，絕大多數(shù)大鼠出現(xiàn)了阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為，但只有60％的動物模型成功(≥240r/40min)。而DL0705給藥3周并未降低阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)(P＞0.05)，對自發(fā)活動雖有一定的改善作用，也未達顯著性差異(P＞0.05)。但DL0705可顯著改善帕金森病大鼠的肌電活動，降低震顫的頻率和幅度(P＜0.01)。6-OHDA使紋狀體的多巴胺類遞質(zhì)降低了98％以上，由于損傷嚴重，DL0705雖然對多巴胺類

12、遞質(zhì)雖然有一定的改善作用，但均未達顯著性差異(P＞0.05)。6-OHDA使黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目降低了95％以上，因此，DL0705也未顯示出其顯著的保護作用(P＞0.05)。但總的結(jié)果表明，DL0705還是對帕金森病有一定的改善趨勢，其主要作用可能與有增加單胺類遞質(zhì)如DA、HVA和5-HT水平的趨勢，可抑制氧化應(yīng)激，如可顯著抑制脂質(zhì)過氧化水平(P＜0.05)，顯著增加抗氧化酶GSH-Px水平(P＜0.01)，有降低MPO活性的趨

13、勢，顯著抑制星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生(P＜0.01)有關(guān)，但這些仍然不能很好的解釋其對肌電的改善作用。根據(jù)肌電產(chǎn)生的病理機制，除DL0705對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用可減輕震顫外，也不排除外周的作用參與。本實驗進一步考察了DL0705對外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DL0705對外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度有一定的抑制作用。 第四章：DL0705對氧化震顫素致小鼠震顫的作用研究 多巴胺和膽堿能系統(tǒng)的失衡是帕金森病的一個重要的病理機制

14、。為了考察DL0705對膽堿系統(tǒng)的作用，本章采用小鼠腹腔注射氧化震顫素建立小鼠震顫模型，通過檢測小鼠的肌肉震顫和腺體分泌情況來評價DL0705對膽堿系統(tǒng)的影響。 結(jié)果顯示，氧化震顫素可直接激動M受體從而引起震顫。小鼠腹腔注射氧化震顫素后，肌肉震顫明顯可見，全身腺體分泌增加(P＜0.05)，而未見DL0705對震顫程度的抑制作用(P＞0.05)，也未見其抑制腺體分泌的作用(P＞0.05)。結(jié)合前兩個模型，DL0705對乙酰膽堿酯酶

15、活性無影響的結(jié)果，因此，膽堿系統(tǒng)并不是DL0705作用的主要靶系統(tǒng)，但還需進一步的實驗來驗證。 第五章：黃酮類化合物及其組合抗帕金森病作用比較及機制探討 總結(jié)前面的實驗結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)DL0705的抗炎和抗氧化作用在帕金森病中發(fā)揮了重要的作用，而抗炎和抗氧化作用是黃酮類化合物的共同特性。本章旨在探討DL0705的抗帕金森病作用是其特有的作用還是結(jié)構(gòu)相似的黃酮類物質(zhì)的一般特性?；邳S酮類化合物抗氧化作用的構(gòu)效關(guān)系和前期高通

16、量篩選的結(jié)果，本研究選取了另外兩種化合物DL0407和DL0609，研究它們單用和合用在三種不同的帕金森病動物模型中的作用。 結(jié)果顯示，這兩種化合物無論單用還是合用均表現(xiàn)出不同程度的抗帕金森病的作用。DL0609單獨應(yīng)用不僅強于DL0407和DL0705的單獨作用，而且強于DL0407和DL0609合用的效果，這一方面可能與其強的抗氧化作用有關(guān)，另一方面它還對膽堿能系統(tǒng)具有一定的影響?；谙嗉雍蛥f(xié)同作用的理論，可以推測黃酮類化合

17、物之間的作用可能為相加作用，可能通過相同或相似的機制起作用。因此，雖然黃酮類化合物的抗氧化性質(zhì)非常重要，但這不可能是它們產(chǎn)生效應(yīng)的唯一解釋。綜合現(xiàn)已報道的黃酮類化合物的中樞作用機制，發(fā)現(xiàn)他們主要作用于多巴胺，5-羥色胺，膽堿，腎上腺素等受體，這可能是黃酮類化合物在抗帕金森病作用時起效較快的一種解釋，而且也可能是通過作用于受體來增加單胺類遞質(zhì)的含量，且增加的5-HT和腎上腺素也是促進PC12細胞分化和軸突生長的一種解釋。結(jié)合本實驗一些相關(guān)