白介素-6對人肝臟藥物代謝酶（HCE1、HCE2、CYP3A4）表達的影響及分子機制.pdf

1、1985年WHO提出“合理用藥要求患者接受的藥物適合其臨床的需要，藥物劑量應(yīng)符合患者的個體化要求”。藥物的劑量、血藥濃度和臨床效應(yīng)之間有著直接的關(guān)系，這個關(guān)系是確定臨床服藥劑量的基礎(chǔ)。其中血藥濃度是藥效學(xué)的最重要參數(shù)，受藥物代謝酶影響。肝臟是機體代謝和清除藥物的主要器官，可表達多種藥物代謝酶(Drug-metabolizing enzyme,DMEs)包括Ⅰ相酶(如CYP3A4、HCEs等)、Ⅱ相酶(UGT、GST等)、Ⅲ相酶(各種轉(zhuǎn)運

2、體)。 細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYPs)酶系組成了含鐵蛋白超家族。從代謝外源性物質(zhì)的種類和數(shù)量的角度看，它是Ⅰ階段生物轉(zhuǎn)化中最為重要的酶系。其中，CYP3A4可代謝60％的臨床現(xiàn)存處方藥物；人羧酸酯酶Human carboxylesterases，HCEs)廣泛分布機體的各種組織，承擔(dān)各種包含酯類藥物生物轉(zhuǎn)化的功能，包括激活前藥物的作用。 很多實驗證明，遺傳(遺傳多態(tài)性)、年齡、藥物(包括草藥

3、)、飲食習(xí)慣、吸煙和酗酒等因素可通過直接或間接作用調(diào)節(jié)DMEs，影響其活性。臨床上還發(fā)現(xiàn)，在一些病理狀態(tài)下，尤其是宿主出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，肝臟的DMEs表達降低，活性下調(diào)，造成藥物清除率明顯下降達20-70％，進而引起血漿藥物濃度增高產(chǎn)生藥物毒性反應(yīng)。白介素-6(interleukin-6 IL-6)目前被公認(rèn)為炎癥時能引起肝臟炎癥反應(yīng)中最重要的細(xì)胞因子之一。 除此之外，腫瘤已成為世界各國繼心血管疾病之后的第二大威脅人類健康的疾病。

4、在2000年，中國每年新增腫瘤病人160萬，死亡130多萬人，現(xiàn)患病380萬人，預(yù)計2050年惡性腫瘤發(fā)病和死亡例數(shù)將是2000年2倍以上。腫瘤的病因和發(fā)生機制并不十分清楚，但與感染炎癥密切相關(guān)。因此，研究IL-6對CYP3A4、HCEl、HCE2的影響及其機制的調(diào)節(jié)，可為指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。合理的藥物劑量，用藥時間，既可提高療效，避免用藥過量，降低毒性反應(yīng)，又可節(jié)約資金，產(chǎn)生巨大社會和經(jīng)濟效益。 第一部分相關(guān)質(zhì)粒構(gòu)建

5、 目的：構(gòu)建人PXR、遺傳多態(tài)性PXR、HCE1、HCE2等表達質(zhì)粒、人CYP3A4、HCE1、HCE2熒光素酶報告基因質(zhì)粒。 方法：采用克隆、亞克隆以及點突變技術(shù)構(gòu)建人PXR的表達質(zhì)粒、人CYP3A4、HCE1、HCE2熒光素酶報告質(zhì)粒。并進行酶切初步鑒定，序列測定進一步證實。在此基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用wester blot、熒光素酶活性鑒定其功能。 結(jié)果：構(gòu)建包括野生型(wild type，WT)以及人群遺傳多態(tài)

6、性(polymorphism)12種人PXR表達質(zhì)粒；包括人和大鼠野生型和人PXR和大鼠PXR雜交的human-rat PXR(hRPXR)16種表達質(zhì)粒；HCE1和HCE2表達質(zhì)粒。一系列不同長短含luciferase基因CYP3A4熒光素酶報告質(zhì)粒；含luciferase基因HCE1和HCE2熒光素酶報告質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blot證實有相應(yīng)蛋白表達。 結(jié)論：證實所構(gòu)建的質(zhì)粒正確并具有功能，為探討IL6對肝臟CY

7、P3A4、HCE1、HCE2的影響及分子機制打下基礎(chǔ)。 第二部分IL-6抑制人肝細(xì)胞HCE1、HCE2表達和活性及分子機制的研究 目的：研究IL6對人肝細(xì)胞HCE1、HCE2表達和活性的影響，并探討其分子機制。 方法：應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測IL6處理原代培養(yǎng)人肝細(xì)胞或肝腫瘤細(xì)胞株HepG2細(xì)胞后HCE1、HCE2在mRNA水平和蛋白水平變化，用酶學(xué)測定IL-6對人原代培養(yǎng)肝細(xì)

8、胞和肝腫瘤細(xì)胞株HepG2的HCE1和HCE2酶活性的影響。構(gòu)建HCE1及其變異體啟動子熒光素J酶報告基因質(zhì)粒，探討IL-6影響HCE1表達和活性的分子機制。 結(jié)果：IL6明顯降低原代培養(yǎng)人肝細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞株HepG2的HCE1和HCE2的表達(40-60％)同時降低酶的活性(40-60％)。RNA抑制劑可完全取消IL-6抑制HepG2的HCE1和HCE2表達的作用，以及IL-6可抑制HCE1和HCE2啟動子報告基因，提示IL

9、-6抑制HCE1和HCE2的表達和抑制酶活性與其轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。并發(fā)現(xiàn)IL-6抑制HCElA2轉(zhuǎn)錄的部位是位于轉(zhuǎn)錄起始部位上游-8213至-7813之間區(qū)域。用IL6預(yù)處理細(xì)胞后，可降低肝細(xì)胞HCE1和HCE2的表達和抑制酶的活性，使經(jīng)這兩種酶代謝的藥物(如oseltamivir等)的作用和毒性反應(yīng)發(fā)生改變。 第三部分IL-6抑制人肝細(xì)胞CYP3A4表達和活性及分子機制的研究 目的：研究IL-6對人肝細(xì)胞CYP3A4表達和

10、活性的影響，并探討其分子機制。 方法：應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測IL-6處理原代培養(yǎng)人肝細(xì)胞或人肝腫瘤細(xì)胞(HepG2)后，肝細(xì)胞的CYP3A4在mRNA水平和蛋白水平變化，同時測定IL-6對肝細(xì)胞CYP3A4酶活性的影響。采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染PXR表達質(zhì)粒和SiPXR使核受體PXR過度表達或kaaockdown以及不同片斷CYP3A4啟動子熒光素酶報告基因，探討IL-6影響CYP3A4表達和活性的分子

11、機制。 結(jié)果：IL-6使原代培養(yǎng)人肝細(xì)胞和HepG2的CYP3A4的表達明顯降低，酶的活性降低。IL-6可明顯抑制CYP3A4熒光素酶報告基因，用SiPXR使細(xì)胞PXR基因knockdown，則取消IL-6抑制CYP3A4作用，提示IL-6抑制肝細(xì)胞的表達和活性與核受體PXR相關(guān)。IL-6可抑制人PXR和大鼠PXR，對自然界人體存在的12種PXR變異體均有抑制作用。此外，研究結(jié)果還提示IL6抑制肝細(xì)胞表達CYP3A4可能通過DE

12、C1介導(dǎo)。 結(jié)論：(1)炎癥細(xì)胞因子可對多種藥物代謝酶發(fā)揮廣泛的抑制作用；(2)IL-6抑制藥物代謝酶存在多種機制，獨立或共同發(fā)揮作用，主要取決于靶基因；(3)IL-6抑制肝細(xì)胞CYP450(CYP3A4)的表達具有重要的藥理學(xué)和毒理學(xué)意義。 綜上所述，本研究工作的主要創(chuàng)新之處在于： 1.應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法研究炎癥介質(zhì)(IL-6)引起藥物代謝酶降低的分子機制。 2.應(yīng)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建藥物代