人參皂苷Rb1通過(guò)抑制L-型電壓門(mén)控鈣通道的活性改善Aβ-,25-35-誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元鈣平衡紊亂.pdf

1、本研究擬從上述這兩方面來(lái)探討Rb1對(duì)鈣超載影響的可能機(jī)制。 方法：應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)通過(guò)設(shè)定的不同刺激方案記錄原代培養(yǎng)7d海馬神經(jīng)元上的電壓門(mén)控的鈣通道電流(voltage-gated calcium channel current，VGCC)。利用細(xì)胞外灌流、細(xì)胞內(nèi)液給藥及預(yù)孵育等給藥方式，同時(shí)分別應(yīng)用各型鈣通道特異性阻斷劑或各種蛋白激酶的抑制劑，通過(guò)比較加藥前后或不同組間電流幅度的變化探討Aβ25-35對(duì)VGCC的調(diào)控及R

2、b1對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流的作用機(jī)制。預(yù)先用鈣高度特異性熒光探針Fluo-3/AM負(fù)載海馬神經(jīng)元，進(jìn)行熒光染色，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀(guān)察在不同藥物干預(yù)條件下海馬神經(jīng)元內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度的變化探討Aβ25-35對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)調(diào)控及Rb1對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放的影響。 結(jié)果：(1)在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上存在多種的鈣電流成分(L、N、P/Q、T等)，它們具有各自不同的藥理學(xué)及動(dòng)力學(xué)特性；急性給予10μmolL

3、-I凝聚態(tài)Aβ25-35對(duì)VGCC沒(méi)有影響；10μmoIL-1凝聚態(tài)Aβ25-35預(yù)孵育3、6、12、24h后，各組電流均較對(duì)照組有不同程度的增加，并以預(yù)孵育3h記錄到的高電壓激活的鈣電流( HVA-Ica)變化為著，而預(yù)孵育對(duì)細(xì)胞的膜電容沒(méi)有影響。(2)L-型鈣通道的特異性抑制劑nifedipine完全抑制了凝聚態(tài)Aβ25-35誘導(dǎo)的Ca2+通道電流的增加；N型鈣通道特異性抑制劑ω-conotoxin GVIA及P/Q型通道特異性的抑

4、制劑ω-agatoxin IVA均無(wú)法完全抑制凝聚態(tài)Aβ25-35誘導(dǎo)的Ca2+通道電流的增加。PKA抑制劑H-89部分抑制了Ap預(yù)孵育組的電流，而MAPK抑制劑PD98059無(wú)法抑制Aβ誘導(dǎo)的電流的增大。(3)2、10、20μM各濃度組凝聚態(tài)Aβ25-35均增加了海馬神經(jīng)元胞內(nèi)[Ca2+]i；IP3R的特異性抑制劑2-APB明顯地抑制了胞內(nèi)[Ca2+]i的增加，蘭尼鹼受體(RyR)的特異性抑制劑dantrolene卻無(wú)法抑制。Aβ25

5、-35作用1h后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣容量即有明顯下降，在作用24h后降低更為明顯。在無(wú)細(xì)胞外鈣情況下，磷脂酶C的抑制劑U73122部分抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)的胞內(nèi)[Ca2+]i的增加。(4)人參皂苷Rb1可以濃度依賴(lài)性的方式抑制海馬神經(jīng)元上VGCC，并且抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)的VGCC。Nifedipine完全阻斷了之前1βMRb41對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的VGCC的抑制，而ω-conotoxin-GVIA、ω-agatoxin IVA等作用前后

6、1μMRb1對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的VGCC的抑制作用沒(méi)有受到影響；Rb1使Aβ25-35作用的穩(wěn)態(tài)失活曲線(xiàn)向左即超極化方向偏移，而對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的VGCC的激活特性沒(méi)有影響；cAMP的類(lèi)似物Forskolin并沒(méi)有消除10μM Rb1對(duì)VGCC的抑制，Rb1對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的VGCC的抑制率亦沒(méi)有被PKA/PKC抑制劑staurosporine所影響。在無(wú)細(xì)胞外鈣情況下，各濃度組Rb1不能抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)

7、度的增強(qiáng)。 結(jié)論：凝聚態(tài)Aβ25-35可通過(guò)PKA系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞膜上特定的鈣通道進(jìn)行磷酸化調(diào)控增大VGCC。Aβ25-35可通過(guò)IP3途徑產(chǎn)生IP3作用于IP3R而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的釋放，磷脂酶C的活化可能參與了上述過(guò)程。人參皂苷Rb1是一種鈣通道阻滯劑，它通過(guò)選擇性地作用于L-型電壓門(mén)控的鈣通道，影響鈣通道的失活過(guò)程，即通過(guò)加速通道向失活態(tài)的轉(zhuǎn)化抑制通道的活性從而抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)的VGCC。Rb1對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣