ALS相關突變蛋白SOD1-G93A介導PC12細胞損傷.pdf

1、目的:肌萎縮側索硬化是一種神經(jīng)變性疾病，其特征是選擇性的侵犯脊髓前角細胞、腦干后組運動神經(jīng)元、皮質錐體細胞及錐體束，導致上、下運動神經(jīng)元變性死亡，患者出現(xiàn)嚴重的肌無力，多數(shù)終因呼吸肌受累而死于呼吸衰竭。全世界范圍內對ALS的研究目前主要集中于SOD1-G93A的轉基因小鼠模型，所以將研究擴展到其他模型以進一步探討SOD1-G93A在ALS致病中的作用就具有重要意義。本實驗采用突變的人SOD1-G93A質粒轉染PC12細胞，從氧化應激、線

2、粒體異常改變以及細胞凋亡的角度探討SOD1-G93A對PC12細胞的影響極其可能的作用機制。為將來進一步的研究打下基礎。
　　方法:
　　1、實驗分組
　　實驗設置空白對照組、轉染空質粒對照組以及轉染人SOD1-G93A組。
　　2、細胞培養(yǎng)及細胞轉染
　　復蘇凍存于液氮罐中的高分化PC12細胞，以含有滅活的胎牛血清及青鏈霉素的10％高糖DMEM作為培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。細胞復蘇傳

3、代3次以后，待突起明顯、形態(tài)規(guī)則、融合密度為80％時，取對數(shù)生長期分別轉染人SOD1-G93A質粒、空質粒至PC12細胞。轉染過程嚴格遵守LipofectamineTM2000試劑說明書的操作規(guī)范。轉染48h后收集細胞樣本用于實驗研究。
　　3、丙二醛檢測
　　收集并裂解細胞，使用硫代巴比妥酸(TBARS)法測定細胞MDA水平。嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作，在532nm波長處讀取樣本吸光度。
　　4、蛋白質免疫印跡

4、
　　提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度。以30ug蛋白為上樣量，進行鈉十二烷基的硫酸鹽(SDS)聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳，然后將凝膠上的蛋白轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜與一抗在4℃搖床下孵育過夜。次日再與結合有熒光染料的二抗孵育。Odyssey紅外圖像掃描系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描以確定目的蛋白的表達水平。
　　5、細胞凋亡率測定
　　消化貼壁的PC12細胞，制成單細胞懸液，離心

5、去上清以后加入PBS重懸細胞并計數(shù)，取1-5×105個細胞離心去上清，加入500ullxBindingbuffer重懸細胞，加入10ulPI，室溫避光孵育5min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　6、活細胞線粒體觀測
　　用移液器沿側壁小心去除激光共聚焦顯微鏡專用玻底培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液，37℃溫浴的D-Hank's洗兩遍，加入1ml不含酚紅和抗生素的DMEM培養(yǎng)基，按線粒體染色劑(mitoredtracker)/培養(yǎng)基為1

6、∶1000的比例，加入線粒體染色劑，輕輕混勻，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育45分鐘。15分鐘后以1∶500的比例加入核染色劑Hoechst，培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。孵育完畢后去除培養(yǎng)液，D-Hank's洗一遍，加入不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基，拿出培養(yǎng)室進行confocal觀測。
　　結果:
　　1、成功的培養(yǎng)PC12細胞并完成質粒轉染
　　倒置熒光顯微鏡顯微鏡下觀察，我們培養(yǎng)的PC12細胞貼壁良好形態(tài)規(guī)則，突起明顯;

7、SOD1-G93A質粒轉染成功，蛋白質免疫印跡法在對應位置檢測到含有EGFP標簽的外源性SOD1，流式細胞儀測定轉染效率為20.1％。
　　2、丙二醛水平測定
　　MDA含量代表了細胞脂質過氧化水平，可間接反映氧化應激水平。轉染48h后提取細胞蛋白測定MDA，結果顯示SOD1-G93A組MDA值明顯高于對照組(p＜0.01)，有統(tǒng)計學意義。這表明轉染人SOD1-G93A引發(fā)了PC12細胞脂質過氧化損傷。
　　3、血紅素

8、氧合酶1表達水平測定
　　HO-1是體內重要的抗氧化酶，在多種刺激條件下可被誘導，比如氧化應激。在PC12細胞轉染人SOD1-G93A，48h后提取細胞蛋白用于蛋白質免疫印跡，觀測血紅素氧合酶1的變化。結果顯示HO-1在轉染人SOD1-G93A組相比于對照組明顯升高(p＜0.01)，有統(tǒng)計學意義。
　　4、細胞凋亡率
　　凋亡中、晚期細胞，細胞膜的完整性受到比較嚴重的破壞，溴化乙錠可進入細胞內將細胞核紅染，以此可較為客

9、觀地判定細胞凋亡率。轉染人SOD1-G93A48h后收集細胞用于凋亡率檢測。結果顯示轉染人SOD1-G93A組細胞凋亡率高達40.9％，正常對照組僅為9.7％。
　　5、線粒體形態(tài)改變
　　轉染48h后hoechst標記細胞核，mitored標記線粒體，直接觀測激光共聚焦顯微鏡專用玻底培養(yǎng)皿中的活細胞。過表達SOD1-G93A組細胞出現(xiàn)較為明顯的線粒體碎片，且偶見巨型線粒體聚集體。
　　結論:
　　SOD1-G9