共表達(dá)結(jié)核分枝桿菌CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原重組腺病毒的構(gòu)建及免疫學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、結(jié)核?。═uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性致死性人獸共患性傳染病。該病傳染性強(qiáng)，潛伏期長(zhǎng)，致死率高，是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的三大傳染性疾病之一。牛分枝桿菌減毒株 BCG（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin，BCG）作為目前唯一的抗結(jié)核疫苗，在全世界范圍內(nèi)廣泛使用，對(duì)人類(lèi)預(yù)防結(jié)核病發(fā)揮了巨大的作用，

2、但其所能提供的免疫保護(hù)力有限。雖然目前已經(jīng)有很多新型抗結(jié)核疫苗處于實(shí)驗(yàn)研究階段，但是仍然沒(méi)有新疫苗可取代 BCG。鑒于目前抗結(jié)核病疫苗的研究現(xiàn)狀，為了能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了病毒載體疫苗的研究，其中腺病毒載體是頗受關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。本論文的目的在于采用人5型腺病毒（Human adenovirus serotype5，Ad5）構(gòu)建共表達(dá)結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢(shì)抗原基因CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85

3、B的重組腺病毒載體Ad5-CEAB，并以小鼠為動(dòng)物模型研究重組腺病毒Ad5-CEAB的免疫原性，這不僅具有重要的科學(xué)意義，研究結(jié)果也將為抗結(jié)核新型疫苗的研制提供理論依據(jù)。
　　首先，我們選取了4種結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢(shì)抗原 CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B基因，構(gòu)建了一種可同時(shí)表達(dá)這4種抗原的真核多基因共表達(dá)載體pcDNA-CMV-CFP10-linker-ESAT6-RSV-Ag85A-IRES-Ag85B（pcDNA-

4、CEAB）。測(cè)序驗(yàn)證后再用限制性?xún)?nèi)切酶將 CFP10-linker-ESAT6-RSV-Ag85A-IRES-Ag85B片段整體從質(zhì)粒pcDNA-CEAB中切下，插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒pacAd5 CMV K-N pA vector中，與腺病毒骨架質(zhì)粒pacAd59.2-100 Ad backbone vector共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，獲得重組腺病毒Ad5-CEAB。重組腺病毒Ad5-CEAB經(jīng)Western blotti

5、ng驗(yàn)證后進(jìn)行大量擴(kuò)增，并用氯化銫密度梯度離心法進(jìn)行病毒純化，獲得了高滴度的重組病毒Ad5-CEAB。
　　然后，我們以小鼠為動(dòng)物模型對(duì)重組腺病毒Ad5-CEAB的免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)以PBS和BCG作為對(duì)照，用Ad5-CEAB免疫小鼠3次，末免2周后處死小鼠進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，Ad5-CEAB可以刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，尤其是Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。表現(xiàn)在，Ad5-CEAB免疫小鼠后，淋巴細(xì)胞抗原刺

6、激液中的IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12濃度顯著高于PBS組和BCG組。另外，Ad5-CEAB組小鼠血清抗體IgG和IgG2a/IgG1顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)還測(cè)定了小鼠呼吸道黏膜分泌型IgA（secretary IgA，sIgA）的濃度，結(jié)果顯示，Ad5-CEAB組小鼠肺盥洗液中sIgA的濃度顯著高于對(duì)照組?？傊?，Ad5-CEAB免疫小鼠后，能夠刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的呼吸道黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，這些指標(biāo)和對(duì)照組相比，

7、均有顯著的變化。
　　最后，我們以小鼠為動(dòng)物模型，采用BCG初免-Ad5-CEAB加強(qiáng)的異源初免-加強(qiáng)的免疫策略，評(píng)價(jià)Ad5-CEAB作為BCG的加強(qiáng)型候選疫苗，是否具有加強(qiáng)BCG免疫效果的作用。結(jié)果表明，Ad5-CEAB可以顯著的加強(qiáng)BCG的免疫效果。主要表現(xiàn)在，BCG初免-Ad5-CEAB加強(qiáng)免疫后，小鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后，會(huì)分泌高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，這三種細(xì)胞因子的濃度均顯著高于PBS組和BCG組。BC

8、G初免-Ad5-CEAB加強(qiáng)后，還可以有效的刺激小鼠分泌IgG抗體，血清IgG抗體濃度顯著高于對(duì)照組。另外，小鼠肺盥洗液中sIgA濃度也顯著高于對(duì)照組。說(shuō)明采用BCG初免-Ad5-CEAB加強(qiáng)的異源初免-加強(qiáng)的免疫策略能夠有效的刺激小鼠產(chǎn)生呼吸道黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。此外，我們還比較了BCG初免后，用Ad5-CEAB加強(qiáng)1次和加強(qiáng)2次的免疫效果。結(jié)果表明，Ad5-CEAB加強(qiáng)1次也能刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，尤其是黏膜

9、免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　綜上所述，本論文成功的構(gòu)建了重組腺病毒載體Ad5-CEAB，該病毒采用了雙啟動(dòng)子表達(dá)的策略，利用CMV啟動(dòng)子和(Gly4Ser)3蛋白linker實(shí)現(xiàn)了CFP10和ESAT6的融合表達(dá)，利用RSV啟動(dòng)子和IRES序列實(shí)現(xiàn)了Ag85A和Ag85B蛋白的獨(dú)立表達(dá)。最終，在同一個(gè)病毒載體中共表達(dá)了4種結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢(shì)抗原基因。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明我們構(gòu)建的重組腺病毒Ad5-CEAB具有很強(qiáng)的刺激機(jī)體產(chǎn)生局部黏膜

10、免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力。另外，Ad5-CEAB還可以加強(qiáng)BCG的免疫效果。本研究制備的重組腺病毒載體Ad5-CEAB被實(shí)驗(yàn)證明具有很好的免疫原性。我們將在以后的研究中繼續(xù)對(duì)Ad5-CEAB開(kāi)展深入的研究，主要包括在其他動(dòng)物模型中繼續(xù)驗(yàn)證，條件成熟后進(jìn)行強(qiáng)毒株攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)等。Ad5-CEAB有望成為一種新型的抗結(jié)核候選疫苗，BCG初免-Ad5-CEAB加強(qiáng)的異源初免-加強(qiáng)的免疫策略也有望成為一種新型的抗結(jié)核免疫策略，值得更