雌激素缺乏對(duì)大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂是神經(jīng)外科最常見(jiàn)的急診疾病之一,是蛛網(wǎng)膜下腔出血的首要因?yàn)?占60％左右。其發(fā)病前無(wú)明顯預(yù)兆,發(fā)病急,癥狀重,死亡率及致殘率高。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂所致的蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)病率每年6-21/100,000人。腦血管病是我國(guó)居民的第二位死因,1998年衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)我國(guó)腦血管病死亡人數(shù)城市達(dá)137.72/10萬(wàn),農(nóng)村地區(qū)達(dá)113.05/10萬(wàn)。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂所致死亡率可達(dá)50％,約25％的患者將遭

2、受偏癱、失語(yǔ)、失明等永久性的殘疾,而且生存下來(lái)的患者動(dòng)脈瘤有隨時(shí)破裂的可能。另有人統(tǒng)計(jì)第一次出血死亡率可高達(dá)40％,第二次出血死亡率可達(dá)60％。綜合文獻(xiàn)報(bào)道初次出血24小時(shí)內(nèi)出血率最高,達(dá)4.1％,以后每天下降為1.5％,1個(gè)月后再出血率銳減,大約為每年3-4％。未破裂動(dòng)脈瘤每年發(fā)生再次的危險(xiǎn)介與1-2％之間。所以對(duì)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤,應(yīng)積極予以治療。目前常用的治療方法有兩種:一種是顯微神經(jīng)外科手術(shù)夾閉動(dòng)脈瘤瘤頸,使動(dòng)脈瘤置于血液循環(huán)外,避開(kāi)

3、血流沖擊,從而避免動(dòng)脈瘤再次破裂；另一種是血管內(nèi)介入治療技術(shù),通過(guò)導(dǎo)管將栓塞材料填塞于動(dòng)脈瘤瘤腔內(nèi),避開(kāi)血流沖擊。近年來(lái),神經(jīng)內(nèi)境,神經(jīng)導(dǎo)航系統(tǒng)等應(yīng)用提高了顯微外科手術(shù)的療效；隨著影像學(xué)的不斷發(fā)展,介入新材料的出現(xiàn),血管內(nèi)治療動(dòng)脈瘤的療效也越來(lái)越好,有部分學(xué)者提出將栓塞治療作為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的首選治療方法。
　　 隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展,對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的臨床治療已經(jīng)取得了很大的發(fā)展,但對(duì)其形成、生長(zhǎng)、破裂的機(jī)制還不很清楚。動(dòng)脈瘤的發(fā)病

4、是多因素的,通常按其不同病因分為5類(lèi):①先天性動(dòng)脈瘤;②感染性動(dòng)脈瘤;③外傷性動(dòng)脈瘤;④動(dòng)脈硬化性動(dòng)脈瘤;⑤剝離性動(dòng)脈瘤。其中絕大部分是“先天性動(dòng)脈瘤”,即通常稱(chēng)之為囊性動(dòng)脈瘤(sacctnar aneurysm)或漿果樣動(dòng)脈瘤(berryaneurysm)。動(dòng)脈瘤的病因大概可以分為三類(lèi):遺傳或先天性因素致病的先天學(xué)說(shuō)、顱內(nèi)動(dòng)脈獲得性退行性病變導(dǎo)致血管破壞的后天學(xué)說(shuō)和綜合學(xué)說(shuō)。近年來(lái)人們?cè)噲D通過(guò)對(duì)動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型的研究,揭示顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病

5、因發(fā)病機(jī)理,為臨床研究提供條件。而如何設(shè)計(jì)和制作與人體動(dòng)脈瘤生理特性相一致的動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型是開(kāi)展此類(lèi)研究的基礎(chǔ)、難點(diǎn)和關(guān)鍵。目前制作動(dòng)脈瘤模型的主要方法主要有:外科手術(shù)移植法、動(dòng)脈局部破壞法、酶破環(huán)血管壁法、血管內(nèi)介入法,病因誘導(dǎo)法等。
　　 現(xiàn)在比較公認(rèn)的動(dòng)脈瘤常見(jiàn)發(fā)病危險(xiǎn)因素有吸煙、酗酒、高血壓,這些危險(xiǎn)因素在男性中比在女性中更普遍,但流行病學(xué)資料顯示,女性特別是絕經(jīng)后發(fā)病率明顯高于男性(ratio:60/40),大多女性患

6、者集中在50-59歲年齡段。流行病學(xué)資料調(diào)查顯示,顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者39歲以下女性占44％,40-49歲女性占55％,50-59歲女性占到77％。W.T.Longstreth等研究也發(fā)現(xiàn)[8],女性絕經(jīng)前的蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病率要比絕經(jīng)后低(odds ratio,0.24:CI,0.09-0.68),長(zhǎng)期或經(jīng)常服用雌激素替代治療的絕經(jīng)后女性比不服用雌激素絕經(jīng)后女性發(fā)病率會(huì)降低(p<0.002)。
　　 第一部分:低雌激素水平模型、動(dòng)脈

7、瘤模型的制作及標(biāo)本的獲取和初步研究
　　 目的：
　　 建立雌激素缺乏的動(dòng)脈瘤模型,并且在此基礎(chǔ)上初步研究雌激素缺乏對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成及生長(zhǎng)的影響及可能機(jī)制。
　　 方法
　　 雌性Wistar大鼠30只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組,各10只。實(shí)驗(yàn)組:切除雙側(cè)卵巢+動(dòng)脈瘤模型；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組:切除雙側(cè)卵巢旁與其大小相當(dāng)?shù)囊粔K脂肪+動(dòng)脈瘤模型；空白對(duì)照組:不做任何處理。大鼠去勢(shì)模型或腹部假手術(shù)模型制作

8、后2周后,用豬胰彈性蛋白酶(E1250 Sigma)滴加到頸外動(dòng)脈及分叉處動(dòng)脈壁周?chē)?在頸外動(dòng)脈距分叉處約1.5mm位點(diǎn),用兩根手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎頸外動(dòng)脈,在兩根線(xiàn)之間剪斷頸外動(dòng)脈,使頸外動(dòng)脈的盲段形成頸內(nèi)動(dòng)脈的一個(gè)動(dòng)脈瘤。動(dòng)脈瘤模型制作6周后,快速打開(kāi)大鼠胸腔暴露心臟,右心房取 全血2ml,離心、取上清液后于-20℃冰箱保存,用于檢測(cè)大鼠血清中雌激素的含量；同時(shí)取實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的動(dòng)脈瘤組織和空白對(duì)照組相應(yīng)的一段頸外動(dòng)脈組織,用于常規(guī)組織切

9、片染色。
　　 結(jié)果
　　 血漿中雌激素水平實(shí)驗(yàn)組為(105.00±12.96)pmol/L,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為(178.50±25.96)pmol/L,空白對(duì)照組(180.40±18.70)pmol/L；實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組分別比較(p<0.01),與兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)脈瘤長(zhǎng)度擴(kuò)張率(131.31±6.63)％,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)脈瘤長(zhǎng)度擴(kuò)張率(109.90±3.44)％,Z=9.061,p<0.01,。實(shí)驗(yàn)

10、組動(dòng)脈瘤直徑擴(kuò)張率(125.10±5.49)％,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)脈瘤直徑擴(kuò)張率(106.82±2.49)％,t=9.597,p<0.01.
　　 結(jié)論
　　 雌激素缺乏對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成、生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,本研究使用盲段法結(jié)合酶消化法制作動(dòng)脈瘤模型簡(jiǎn)便可行。
　　 第二部分 雌激素缺乏對(duì)大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織MMP-9表達(dá)影響的研究
　　 目的：
　　 應(yīng)用第一部分所取得的動(dòng)脈瘤組織標(biāo)本,初步研究雌激

11、素缺乏對(duì)動(dòng)脈瘤組織MMP-9表達(dá)的影響。
　　 方法
　　 1.免疫熒光:從-20℃箱取出組織切片,室溫下晾干,清洗；然后加4％多聚甲醛固定,0.01M PBS液清洗,加入配好的5％山羊血清封閉,然后分別加一抗兔抗Anti-MMP-9(1:400),放置于4℃濕盒過(guò)夜；0.01M PBS液再清洗三次；加入羊抗兔IgG(綠色,1:400)熒光標(biāo)記二抗、室溫避光1小時(shí)；再0.01MPBS液清洗3次；滴加封片劑一滴,封片,熒光

12、顯微鏡檢查,或放入4℃冰箱保存待盡早觀察。
　　 2.western Blot:首先測(cè)定樣本蛋白的濃度然后進(jìn)行,清洗玻璃板,灌膠與上樣,電泳,加一抗、二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光,最后顯影,定影.
　　 結(jié)果
　　 免疫熒光:在動(dòng)脈瘤血管壁可見(jiàn)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞主要位于動(dòng)脈壁中、外膜,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組均明顯。western blot:在動(dòng)脈瘤血管壁中都有MMP-9蛋白的存在,實(shí)驗(yàn)組較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組量多,空