調(diào)控JAK2-STAT通路的表達對高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞保護作用的研究.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是導致終末期腎衰的主要原因之一,進一步明確糖尿病腎病的發(fā)病機制,延緩其病情進展是目前亟待解決的問題。我們先前的研究表明,高糖誘導腎小球系膜細胞增生過度(GlomerularMesangial Cells,GMC),分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growthfactot-β1,TGF-β1),結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth f

2、actor,CTGF),促進細胞外基質(zhì)沉積,從而導致腎臟纖維化,是糖尿病腎病的基本特點。
　　 酪氨酸蛋白激酶2/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子(activation of Janus kinase2/signal.transducers and activators of transcription,JAK2/STAT)通路在糖尿病腎病發(fā)病過程中的作用一直是研究的熱點,抑制JAK2-STAT通路激活的有害作用對于治療糖尿病合并癥尤其糖尿

3、病腎病意義重大,普羅布考是一種降血脂藥物,同時具有抗氧化功能,在與免疫性疾病相關(guān)系統(tǒng)疾病的治療中也具有強大的作用,但其作用機理仍有待進一步研究。值得注意的是:通過干擾素γ(IFN-γ)誘導的細胞生長抑制作用需要激活STAT1,即IFN-γ的抗增殖活性通過STAT1的激活而加強,而如果抑制STAT1磷酸化可使其抗增殖活性減弱。STAT1可能是一個關(guān)鍵的保護因子,并將成為今后治療糖尿病腎病的一個新的靶點。
　　 我們研究不同糖濃度下

4、人腎小球系膜細胞(Hunlan Mesangial Cells,HMC)增殖和分泌促纖維化因子的變化,不同糖濃度下人腎小球系膜細胞內(nèi)JAK2/STAT通路的激活狀況;并研究普羅布考和IFN-γ對JAK2/STAT通路的調(diào)控作用和進一步對高糖狀態(tài)下人腎小球系膜細胞的增殖狀況和分泌促纖維化因子變化的影響。
　　 方法：
　　 1、高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞JAK2/STAT通路表達變化及作用的研究體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞,第3

5、-6代細胞用于實驗。實驗分為3組:正常糖濃度組(NG,5.5mmol/L葡萄糖),對照組(NG+19.5mmol/L甘露醇),高糖濃度組(HG,25 mmol/L葡萄糖),刺激時間為48小時。應用MTT方法檢測在刺激48小時后各組細胞增殖狀況;并在48小時刺激結(jié)束后分別收取各組細胞,提取mRNA,進行RT-PCR實驗檢測TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平;提取總蛋白,進行Western-b1ot實驗檢測TGF-β1、CTGF蛋

6、白變化情況,檢測JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3蛋白變化情況。
　　 2、JAK2/STAT通路抑制調(diào)節(jié)普羅布考對高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞保護作用的研究體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞,第3-6代細胞用于實驗。實驗分為6組:正常糖濃度組(NG,5.5mmol/L葡萄糖),高糖濃度組(HG,25 mmol/L葡萄糖),以及高糖添加不同濃度普羅布考(25μ mol/L,50μmol/L,75μ

7、mol/L,100μ mol/L)藥物組,刺激時間為48小時。首先應用MTT方法分別檢測在刺激結(jié)束后各組細胞增殖狀況,篩選出合適的普羅布考藥物濃度；之后按照篩選后的實驗分組在48小時刺激結(jié)束后分別收取各組細胞,提取mRNA,進行RT-PCR實驗檢測TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平；提取總蛋白,進行Western-blot實驗檢測TGF-β1、CTGF蛋白變化情況,檢測JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1、STA

8、T3、P-STAT3蛋白變化情況。
　　 3、激活JAK2/STAT1通路保護高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞的研究體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞,第3-6代細胞用于實驗。實驗分為6組:正常糖濃度組(NG,5.5mmol/L葡萄糖),高糖濃度組(HG,25mmol/L葡萄糖),高糖添加不同濃度IFN-γ(10U/ml,100U/ml,500U/ml)藥物組,HG+100U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟達拉濱組,刺激時間為48小時。首

9、先應用MTT方法分別檢測在刺激結(jié)束后各組細胞增殖狀況,篩選出合適的IFN-γ藥物濃度；之后按照篩選后的實驗分組在48小時刺激結(jié)束后分別收取各組細胞,提取mRNA,進行RT-PCR實驗檢測TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平；提取總蛋白,進行Western-blot實驗檢測TGF-β1、CTGF蛋白變化情況,檢測JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1蛋白變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、高糖狀態(tài)下腎小

10、球系膜細胞JAK2/STAT通路表達變化及作用的研究刺激48小時后,與NG組和對照組相比,HG組P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達增加,有統(tǒng)計學意義。JAK2、STAT1、STAT3蛋白表達無統(tǒng)計學差異。NG組與對照組JAK2、STAT1、sTAT3、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達均無統(tǒng)計學差異。與NG組和對照組相比,HG組人系膜細胞增殖增加,有統(tǒng)計學意義;NG組與對照組系膜細胞增殖無明顯差異。與

11、NG組和對照組相比,HG組TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,有統(tǒng)計學意義,NG組與對照組無明顯差異。刺激48小時比較與NG組和對照組相比,HG組TGF-β1以及CTGF蛋白表達增加,有統(tǒng)計學意義,NG組與對照組無明顯差異。
　　 2、JAK2/STAT通路調(diào)節(jié)普羅布考對高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞保護作用的研究刺激48小時后,與NG組相比,HG組P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達增加,有統(tǒng)計學意義,

12、JAK2、STAT1、STAT3蛋白表達無統(tǒng)計學差異。高糖添加普羅布考(50μ mol/L,75μ mol/L,100μmol/L)藥物組與HG組對比,P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達減少,JAK2、STAT1、STAT3蛋白表達無統(tǒng)計學差異。與NG組相比,HG組人系膜細胞增殖增加,有統(tǒng)計學意義。高糖添加普羅布考(50μ mol/L,75μ mol/L,100μ mol/L)藥物組與HG組對比,系膜細胞增殖減少,有統(tǒng)

13、計學意義,且與普羅布考濃度呈正相關(guān);其中75μ mol/L以及100μ mol/L普羅布考顯示對細胞增殖過度抑制。HG組TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,高糖添加普羅布考(25μ mol/L,50μmol/L)組TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平減低。HG組TGF-β1以及CTGF蛋白表達增加,高糖添加普羅布考(25μ mol/L,50μ mol/L)組TGF-β1以及CTGF蛋白表達減低。
　　 3、

14、激活JAK2/STAT1通路保護高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞的研究刺激48小時后,與NG組相比,HG組P-STAT1、P-JAK2蛋白表達增加,有統(tǒng)計學意義,JAK2、STAT1蛋白表達無統(tǒng)計學差異。HG+100U/ml IFN-γ組與HG組對比,P-STAT1蛋白表達增加,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表達無統(tǒng)計學差異,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表達無統(tǒng)計學差異。HG+1000U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟

15、達拉濱組P-STAT1表達減少,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表達無統(tǒng)計學差異。與NG組相比,HG組人系膜細胞增殖增加,有統(tǒng)計學意義。高糖添加不同濃度IFN-γ(10U/ml,100U/ml,500U/ml)藥物組與HG組對比,系膜細胞增殖減少,有統(tǒng)計學意義,且與IFN-γ濃度呈正相關(guān);其中500U/mlIFN-γ顯示對細胞增殖過度抑制。HG組TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,高糖添加不同濃度IFN-γ(10U/

16、ml,100U/ml)藥物組rGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平減低。HG組TGF-β1以及CTGF蛋白表達增加,高糖添加不同濃度IFN-γ(10U/ml,100U/ml)藥物組TGF-β1以及CTGF蛋白表達減低,HG+100U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟達拉濱組TGF-β1以及CrGF蛋白表達增加。
　　 結(jié)論
　　 1、高糖狀態(tài)下JAK2/STAT通路激活,人腎小球系膜細胞增殖增加,分泌促纖維化

17、因子TGF-β1和CTGF增加。
　　 2、普羅布考可抑制高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞內(nèi)JAK2/STAT通路激活。普羅布考可抑制高糖狀態(tài)下人腎小球系膜細胞的過度增殖,抑制高糖引起的腎小球系膜細胞分泌促纖維化因子TGF-β1和CTGF增加;JAK2/STAT通路的調(diào)節(jié)與普羅布考對高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞的保護相關(guān)。
　　 3、IFN-γ可促進高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞內(nèi)STAT1激活;IFN-γ可抑制高糖狀態(tài)下人腎小球系膜細胞