高糖高脂作用下腎小球系膜細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病和高脂血癥的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅人們的健康，其腎損害正日益受到人們的重視。 研究表明，腎臟血流動(dòng)力學(xué)、蛋白質(zhì)非酶糖化、多元醇通路激活、細(xì)胞增殖和凋亡等多種因素與：DN的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。另外，脂質(zhì)沉積尚能損傷腎小球系膜細(xì)胞移動(dòng)和收縮功能從而促進(jìn)糖尿病腎病的進(jìn)展。 盡管系膜細(xì)胞在介導(dǎo)糖尿病和高脂血癥所致腎病中的作用研究進(jìn)展頗多，但其具體的發(fā)病機(jī)理至今仍不十分清楚。系膜細(xì)胞的增生、

2、系膜基質(zhì)增多是其共同的病變基礎(chǔ)，但具體牽涉到哪些信號通路、離子通道和哪些蛋白等并不十分清楚，特別是對這些變化因素之間的復(fù)雜的、網(wǎng)絡(luò)式的關(guān)聯(lián)知之甚少，有必要運(yùn)用一種高通量、立體式的方法對這些變化因素進(jìn)行研究。近來的基因組和蛋白質(zhì)組研究技術(shù)就是從整體的角度來研究一種或多種因素對機(jī)體影響的較好的方法，因基因型和表現(xiàn)型的不一致性使人們的視線越來越集中到蛋白質(zhì)組的研究。 本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分別研究高血糖、氧化低密度脂蛋白(Ox-LD

3、L)及兩者共同對人腎小球系膜細(xì)胞的影響，得出了相應(yīng)的雙向電泳圖譜，分別找出了差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)一步對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定了15種蛋白質(zhì)的性質(zhì)，為糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。 目的：高糖、Ox-LDL、高糖+Ox-LDL作用下人腎小球系膜細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究。 方法： 1．將人腎小球系膜細(xì)胞分別置于含正常糖濃度(NC組)、高糖(HG組)、Ox-LDL(OX組)、高糖+Ox-LDL(HO組)及甘露醇高滲

4、對照(OC組)培基中進(jìn)行體外培養(yǎng)48小時(shí)，分別收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解，收集細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，第一向采用固相pH等電凝膠電泳，第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，之后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。 2．應(yīng)用PDQuest雙向電泳圖像分析軟件對2DE圖像進(jìn)行數(shù)字化分析匹配與對比，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理評價(jià)雙向凝膠電泳結(jié)果。 3．在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化與改良。 4．分組在腎小球系膜細(xì)胞2DE圖譜中選取20個(gè)

5、明顯表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)胰蛋白酶解，再進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析； 5．將質(zhì)譜分析得出的肽質(zhì)量指紋圖經(jīng)過MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索分析后，識別鑒定各個(gè)蛋白質(zhì)； 6．通過搜索PDB及SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能查詢。 結(jié)果： 1、采用優(yōu)化的雙向凝膠電泳技術(shù)取得了重復(fù)性較好的2DE圖譜結(jié)果； 2、經(jīng)2-DE分離蛋白質(zhì)，共獲分離膠

6、15塊，每組3塊，通過PDQuest圖象分析軟件對每組三塊膠圖譜分析后顯示：NC組平均蛋白點(diǎn)數(shù) 896±51、匹配點(diǎn)數(shù)733±34、匹配率81.9％；HG組平均蛋白點(diǎn)數(shù)791±86、匹配點(diǎn)數(shù)651±74、匹配率83.5％；OX組平均蛋白點(diǎn)數(shù)698±69、匹配點(diǎn)數(shù)591±54、匹配率84.7％；HO組平均蛋白點(diǎn)數(shù)659±56、匹配點(diǎn)數(shù) 531±42、匹配率80.6％；OC組平均蛋白點(diǎn)數(shù)787±63、匹配點(diǎn)數(shù)657±53、匹配率83.5％。

7、同一組三塊膠的位置重復(fù)性顯示：NC組水平偏差1.08mm±0.21mm，垂直偏差1.78mm±0.64mm；HG 組水平偏差1.04mm±0.13mm，垂直偏差2.05mm±0.64mm；OX 組水平偏差1.25mm±0.25mm，垂直偏差1.89mm±0.51mm；HO 組水平偏差 1.32mm±0.21mm，垂直偏差2.21mm±0.76mm；OC 組水平偏差 1.12mm±0.17mm，垂直偏差2.12mm±0.37mm。HG 組

8、與NC組比較共有差異蛋白質(zhì)點(diǎn)42個(gè)，其中有24個(gè)點(diǎn)僅在NC組表達(dá)，18個(gè)點(diǎn)在HG組表達(dá)上調(diào)；OX組與NC組比較共有差異蛋白質(zhì)點(diǎn)33個(gè)，其中有22個(gè)點(diǎn)僅在NC組表達(dá)，OX組有10個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，1個(gè)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)；OC組與NC組比較共有差異蛋白質(zhì)點(diǎn)35個(gè)，其中27個(gè)點(diǎn)僅在NC組表達(dá)，OC組有8個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)；HO組與NC組比較共有差異蛋白質(zhì)點(diǎn)26個(gè)，其中8個(gè)點(diǎn)僅在NC組表達(dá)，HO組有13個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，5個(gè)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。選取明顯表達(dá)差異的20個(gè)蛋白質(zhì)

9、點(diǎn)作質(zhì)譜分析，對這些蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行肽質(zhì)指紋圖分析，鑒定出15種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞骨架、細(xì)胞連接、細(xì)胞代謝、信號傳導(dǎo)和核酸代謝。 結(jié)論： 1、通過差異蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，高糖促進(jìn)人腎小球系膜細(xì)胞的增生及基質(zhì)堆積可能與高糖引起系膜細(xì)胞的骨架蛋白、細(xì)胞連接蛋白及核酸代謝蛋白的表達(dá)改變有關(guān)。Ox-LDL可引起腎小球系膜細(xì)胞波形蛋白及屬于連環(huán)蛋白家族的PKP4表達(dá)上調(diào)，與核酸代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào)，這可能與高脂誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡

10、有關(guān)；在高糖和高脂共同作用下，系膜細(xì)胞的骨架蛋白、MAPK信號傳導(dǎo)通路蛋白及核酸代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)均發(fā)生改變，這些變化可能通過影響人系膜細(xì)胞的蛋白合成、分化、凋亡及系膜基質(zhì)降解從而加速了糖尿病腎病的進(jìn)程。糖尿病患者合并高脂血癥會(huì)加劇腎臟損害。 2、在15個(gè)鑒定出的蛋白質(zhì)中，多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶9 在腎臟組織中的表達(dá)得到驗(yàn)證；另外，屬于β連環(huán)蛋白的PKP4及半橋粒板蛋白以往只在上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)首次在人腎小球系膜細(xì)胞