炎癥因素對(duì)心房纖顫發(fā)病的預(yù)測(cè)作用及其與心房纖顫高凝狀態(tài)和心肌重構(gòu)的關(guān)系.pdf

1、研究目的： 心房纖顫（房顫）是一種最常見(jiàn)的心律失常，由于其可以造成心排量減少、心室率過(guò)快過(guò)慢，可加重心肌缺血及惡化心功能，并且可引起左房血栓形成和全身栓塞并發(fā)癥（其中腦栓塞形成發(fā)病率高），極大地威脅人民健康，造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 本研究的主要目的包括：中國(guó)人TNF-α啟動(dòng)子區(qū)SNPs位點(diǎn)基因型的分布特點(diǎn)，研究房顫發(fā)病是否伴發(fā)明顯的炎癥標(biāo)記物的變化，研究決定炎癥上游因子TNF-α表達(dá)效率的基因啟動(dòng)子區(qū)各SNP位點(diǎn)不同

2、基因型在房顫患者與非房顫對(duì)照個(gè)體分布情況是否不同，研究房顫發(fā)病的預(yù)測(cè)因子、尤其是不同基因型是否預(yù)示房顫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高低；研究房顫本身是否伴發(fā)高凝狀態(tài)和血小板激活，研究高凝狀態(tài)和血小板激活可能的影響因素，尤其是炎癥因素在這個(gè)過(guò)程起何種作用；研究特發(fā)性房顫和孤立性房顫內(nèi)皮功能、凝血功能和血小板功能的變化特點(diǎn)及對(duì)抗栓治療方案的指導(dǎo)；研究房顫患者本身引起的心臟、特別使雙心房形態(tài)學(xué)改變及其與炎癥因素的相互關(guān)系。 研究方法： 入選房顫患

3、者102例（作為研究組）和性別、年齡和危險(xiǎn)因素匹配的對(duì)照組個(gè)體117例。房顫通過(guò)心電圖或入院診斷進(jìn)行確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：高齡，合并明顯動(dòng)脈硬化性疾病，先心病、風(fēng)心病、心肌病、左室肥厚和心功能不全、等器質(zhì)性心臟病，糖尿病，慢性炎癥性疾病，結(jié)締組織疾病，60天內(nèi)手術(shù)史和急危重癥，腫瘤和重要器官功能衰竭。 詳細(xì)記錄患者病史（尤其是房顫發(fā)病時(shí)間和特點(diǎn)）、體檢情況（重點(diǎn)進(jìn)行血壓測(cè)定、心臟體檢（包括心率、節(jié)律和脈率等各項(xiàng)和身高、體重、腹圍等

4、）、臨床檢驗(yàn)（常規(guī)化驗(yàn)、血生化指標(biāo)、血凝血指標(biāo)和炎癥指標(biāo)等）和臨床檢查結(jié)果（常規(guī)胸片、心電圖和心臟超聲等檢查結(jié)果）。血脂、血糖、血肝腎功能等指標(biāo)采用酶法測(cè)定，血纖維蛋白原（Fib）、部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和凝血時(shí)間等采用酶法測(cè)定，血電解質(zhì)測(cè)定采用電解質(zhì)分析儀直接電極法、血CRP測(cè)定采用免疫濁度法、甲狀腺功能測(cè)定采用放射免疫法。心臟超聲檢查常規(guī)測(cè)量包含以下指標(biāo)：左房前后徑（LAd）、右房上下徑（RAd）、室間隔收縮期厚度（IVSd

5、）、二尖瓣返流程度（MR）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。患者組進(jìn)行射頻消融治療者在術(shù)前72小時(shí)進(jìn)行經(jīng)食道心臟超聲檢查。 留取研究對(duì)象的全血和血清標(biāo)本，部分標(biāo)本用于臨床送檢，全血標(biāo)本用于基因組DNA提取，血清冷凍于-70℃低溫冰箱整批用于TNF-α、P-Selectin和vWF等細(xì)胞因子的檢測(cè)。 全血基因組DNA提取采用德國(guó)QIAGEN全血DNA小量提取試劑盒（QIAamp（）DNA Blood Mini Kits）提取，主

6、要步驟包括細(xì)胞裂解、過(guò)柱吸附、雜質(zhì)洗滌和DNA洗脫。采用瓊脂糖凝膠電泳方法確定DNA質(zhì)量，并采用光密度比對(duì)法確定其濃度。 使用Prime Premier5軟件設(shè)計(jì)TNF-α啟動(dòng)子區(qū)目的片段引物，并交公司進(jìn)行合成。采用PCR方法（美國(guó)Promega PCR擴(kuò)增試劑盒GoTaq（）PCR Core SystemsⅠ）擴(kuò)增基因組DNA的TNF-α啟動(dòng)子區(qū)目的片段，主要步驟包括變性、退火和延伸，并反復(fù)進(jìn)行多個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝

7、膠電泳并與DNA marker進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)片段長(zhǎng)度約為808bp。產(chǎn)物送公司進(jìn)行專(zhuān)業(yè)純化和核酸測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Chromas軟件進(jìn)行讀圖，使用Pubmed網(wǎng)站Blast功能進(jìn)行比對(duì)，確定每個(gè)個(gè)體基因型，尤其是各SNP位點(diǎn)的基因型。 血清細(xì)胞因子檢測(cè)采用免疫酶聯(lián)吸附分析方法（ELISA）檢測(cè)，其中血清TNF-α檢測(cè)采用美國(guó)R&D公司TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒（Human TNF-α/TNFSF1AImmunoassay K

8、it），可溶性P-選擇素（sP-Selectin）檢測(cè)采用武漢博士德公司P-Selectin檢測(cè)試劑盒（Human P-Selectin ELISA Kit），血管病性假血友病因子（vWF）檢測(cè)采用上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司血管性血友病因子（vWF）含量測(cè)定試劑盒。主要步驟包括：結(jié)合抗原（樣本）、結(jié)合酶標(biāo)抗體、洗滌、加底物顯色、終止反應(yīng)并在酶標(biāo)儀上進(jìn)行光密度讀數(shù)。使用軟件Curve Expert1.3對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和標(biāo)本光密度讀

9、數(shù)-濃度轉(zhuǎn)換。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行，計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)性檢驗(yàn)采用單樣本K-S擬和優(yōu)度檢驗(yàn)（1-Sample K-S Test）。如符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用x±S表示；如不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用中位數(shù)（median）（四分位數(shù)間距，IQR）表示。對(duì)于顯著偏態(tài)分布的資料，進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)入?yún)f(xié)方差和回歸分析。 兩組正態(tài)分布的計(jì)量資料均數(shù)比較采用Student t檢驗(yàn)，兩組中有一組以上是非正態(tài)分布的計(jì)量資

10、料均數(shù)比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。兩組計(jì)量資料均數(shù)比較同時(shí)要控制其他對(duì)應(yīng)變量有影響的因素時(shí)采用協(xié)方差分析，將可能有影響的因素作為協(xié)變量。計(jì)數(shù)資料表示為率，兩個(gè)率的比較采用卡方檢驗(yàn)（Fisher's Exact Test）。兩組正態(tài)分布資料相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)；對(duì)于非雙變量正態(tài)分布資料的相關(guān)分析，采用Spearman相關(guān)。兩變量相關(guān)分析同時(shí)控制其他因素對(duì)這種相關(guān)關(guān)系的影響時(shí)采用偏相關(guān)分析，將其他因素作為控制變量。

11、 房顫獨(dú)立預(yù)測(cè)因子估計(jì)采用logistic回歸分析，房顫分組作為應(yīng)變量，其他房顫組與對(duì)照組比較差異顯著性P<0.20的變量以及性別、年齡等一般情況納入作為自變量。-308G/A不同基因型房顫風(fēng)險(xiǎn)推測(cè)采用卡方檢驗(yàn)的“risk estimate”。重要的研究指標(biāo)（包括炎癥促凝指標(biāo)Fibrinogen和sP-Selectin）的影響因素估計(jì)采用多元回歸分析，將這些指標(biāo)分別作為應(yīng)變量，將性別、年齡、分組及單因素相關(guān)分析中分別與這些應(yīng)變量相

12、關(guān)關(guān)系顯著性P<0.20的計(jì)量變量和不同分組應(yīng)變量指標(biāo)差異顯著性P<0.20的分類(lèi)變量作為自變量。 研究結(jié)果： TNF-α啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)片段內(nèi)-851、-575、-419和-244四個(gè)SNP位點(diǎn)未檢測(cè)到少見(jiàn)基因型（或少見(jiàn)堿基）。 房顫組和對(duì)照組的各項(xiàng)血液指標(biāo)相比顯示房顫組和對(duì)照組血TNF-α（pg/ml）的濃度分別為3.84（3.07，4.49）和2.85（2.28，3.60），相比有顯著性差異（P<0.001）；

13、 陣發(fā)性房顫患者和對(duì)照組血Fib水平分別為3.20±0.84和2.77±0.60 g/L（P=0.005），陣發(fā)性房顫患者和對(duì)照組血血sP-selectin水平分別為26.2±5.9和21.5±3.9 ng/mL（P<0.001）。協(xié)方差仍然提示陣發(fā)性房顫Fib和sP-selectin水平分別較對(duì)照組顯著增高。 房顫組和對(duì)照組心動(dòng)過(guò)緩發(fā)生率分別為29.7%和6.8%，相比有顯著性差異（P<0.001）。 -308

14、GG與-308non-GG個(gè)體血TNF-α濃度分別為3.37（2.72，4.44）和3.36（2.83，4.16），兩者相比無(wú)顯著性差異（P=0.600）。 Logistic回歸分析顯示，TNF-α、sP-selectin和LAd均是房顫的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其OR值分別為1.375（95%CI：1.024-1.846，P=0.035）、1.248（95%CI：1.121-1.389，P<0.001）和1.321（95%CI：1.1

15、25-1.552，P=0.001）。 炎癥因素（TNF-α或CRP）與促凝血因素（sP-Selectin或Fib）之間均有顯著的正相關(guān)關(guān)系，尤其是CRP與Fib之間的相關(guān)系數(shù)為0.560（P<0.001）。 多元回歸分析表明，分組因素（是否房顫）標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)為0.446（P<0.001），顯示對(duì)血清sP-Selectin水平有顯著性影響。 研究結(jié)論： 1.本研究未發(fā)現(xiàn)研究人群在-851、-575

16、、-419和-244四個(gè)SNPs位點(diǎn)出現(xiàn)少見(jiàn)堿基。 2.首次發(fā)現(xiàn)房顫患者在TNF-α啟動(dòng)子區(qū)-308位點(diǎn)少見(jiàn)基因型攜帶率顯著增高，并首次證實(shí)-308A攜帶者預(yù)示患房顫風(fēng)險(xiǎn)更高，提示TNF-α基因多態(tài)性影響房顫的易患性，支持炎癥因素作為房顫發(fā)病的病因之一。 3.發(fā)現(xiàn)炎癥標(biāo)記物TNF-α、血小板功能標(biāo)記物sP-selectin和左房大小標(biāo)志LAd為房顫發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，支持炎癥因素在房顫的發(fā)病過(guò)程起作用。 4.證實(shí)

17、房顫時(shí)存在凝血功能激活。血Fib水平的顯著影響因素包括房顫發(fā)生率、性別、年齡和炎癥因素。房顫、女性、高齡和高炎癥水平提示高血Fib水平。首次發(fā)現(xiàn)炎癥因素對(duì)房顫患者凝血指標(biāo)有顯著性影響。 5.證實(shí)房顫時(shí)存在血小板功能激活，未發(fā)現(xiàn)炎癥因素對(duì)其有顯著性影響。 6.證實(shí)陣發(fā)性房顫發(fā)作間歇期有明顯的高凝狀態(tài)和血小板激活。 7.特發(fā)性房顫患者凝血功能和血小板功能激活，孤立性房顫患者凝血功能無(wú)明顯激活，但血小板功能顯著激活。提