沉默膜聯(lián)蛋白A1對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞生物特性的影響.pdf

1、背景:激素性股骨頭缺血性壞死在臨床上較為常見(jiàn)，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究表明，激素性股骨頭缺血性壞死與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力轉(zhuǎn)變、成骨細(xì)胞凋亡增加相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)是國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目“早期激素性股骨頭缺血性壞死的蛋白質(zhì)組學(xué)動(dòng)態(tài)分析”的一部分，前部分實(shí)驗(yàn)顯示，早期激素性股骨頭缺血性壞死動(dòng)物模型股骨頭組織的骨細(xì)胞凋亡增加，膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào)，由此推測(cè)膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力降低、成骨細(xì)

2、胞凋亡增加。膜聯(lián)蛋白A1是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合多功能蛋白，參與細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡的調(diào)控。然而，目前有關(guān)膜聯(lián)蛋白A1基因表達(dá)水平的改變與激素性股骨頭缺血性壞死發(fā)生之間的關(guān)系尚未明確，且未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本研究分三部分。
　　第一部分兔膜聯(lián)蛋白A1基因短發(fā)夾RNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　目的:針對(duì)兔膜聯(lián)蛋白A1基因構(gòu)建短發(fā)夾RNA慢病毒載體，為后續(xù)觀察沉默膜聯(lián)蛋白A1對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞生物特性的影

3、響，以及進(jìn)一步探討激素性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:針對(duì)兔膜聯(lián)蛋白A1基因設(shè)計(jì)RNA干擾靶序列，合成Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與BamHI和EcoRI雙酶切后的pGLV/H1/GFP載體連接成pGLV-shANXA1，PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共轉(zhuǎn)染293 FT細(xì)胞包裝產(chǎn)生慢病毒載體

4、LV-shANXA1，并根據(jù)GFP的表達(dá)測(cè)定慢病毒的滴度。
　　結(jié)果:經(jīng)PCR和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建片段大小及DNA序列與目標(biāo)序列一致，shANXA1片段完全正確插入慢病毒載體pGLV/H1/GFP中。包裝濃縮慢病毒顆粒LV-shANXA1-764、LV-shANXA1-844、LV-shANXA1-901、LV-shANXA1-NC的滴度分別為3.7×108TU/L、4.1×108TU/L、3.6×108TU/L、3.7×108TU/L

5、。
　　結(jié)論:實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建的兔膜聯(lián)蛋白A1基因短發(fā)夾RNA慢病毒載體。
　　第二部分沉默膜聯(lián)蛋白A1基因表達(dá)對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響
　　目的:觀察沉默膜聯(lián)蛋白A1基因?qū)ν霉撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響。
　　方法:取新西蘭大白兔的全骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和純化，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度。用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)值的慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)

6、胞后測(cè)定細(xì)胞的感染效率，并篩選最佳的感染復(fù)數(shù)值。分別用慢病毒載體LV-shANXA1-764、LV-shANXA1-844、LV-shANXA1-901感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞下調(diào)ANXA1基因的表達(dá)，采用Real time PCR和Western blot檢測(cè)慢病毒載體對(duì)ANXA1基因的沉默效率，并篩選最高沉默效率的慢病毒載體。
　　將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分三組:RNA干擾組用慢病毒載體LV-shANXA1-901感染骨髓間充

7、質(zhì)干細(xì)胞下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1基因的表達(dá);陰性對(duì)照組用攜帶無(wú)義基因序列的慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;空白對(duì)照組不加任何干預(yù)措施。采用MTT法評(píng)估各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力;采用堿性磷酸酶染色、礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色和堿性磷酸酶活性的測(cè)定評(píng)估各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。
　　結(jié)果:純化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD44、CD105表達(dá)陽(yáng)性率分別為97.2％和95.8％，而CD45陽(yáng)性率為2.5％。LV-sh

8、ANXA1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)的值為50。感染復(fù)數(shù)為50時(shí)，LV-shANXA1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞感染效率為（91.4±2.7）％。實(shí)時(shí)PCR和Western blot檢測(cè)顯示，LV-shANXA1-901對(duì)膜聯(lián)蛋白A1基因的沉默效率最高，在感染復(fù)數(shù)為50時(shí)，沉默效率可達(dá)70％以上。膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)明顯生長(zhǎng)抑制（P＜0.05），在隨后成骨分化誘導(dǎo)后，細(xì)胞的堿性磷酸酶染色陽(yáng)性率和堿性磷酸酶活性明顯降

9、低(P＜0.05），且茜素紅染色呈陰性反應(yīng)。
　　結(jié)論:慢病毒載體LV-shANXA1-901能有效沉默膜聯(lián)蛋白A1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá);沉默膜聯(lián)蛋白A1基因降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化能力。
　　第三部分沉默膜聯(lián)蛋白A1基因表達(dá)對(duì)兔成骨細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:觀察沉默膜聯(lián)蛋白A1基因?qū)ν贸晒羌?xì)胞凋亡的影響。
　　方法:將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞。用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)值的

10、慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染成骨細(xì)胞后測(cè)定細(xì)胞的感染效率，并篩選最佳的感染復(fù)數(shù)值。按最佳感染復(fù)數(shù)值的慢病毒載體LV-shANXA1-901感染成骨細(xì)胞下調(diào)ANXA1基因的表達(dá)，采用Real timePCR和Western blot檢測(cè)慢病毒載體對(duì)ANXA1基因的沉默效率。
　　將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞后分三組:RNA干擾組用攜帶針對(duì)膜聯(lián)蛋白A1基因的短發(fā)夾RNA慢病毒載體LV-shANXA1感染成骨細(xì)胞

11、下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1基因的表達(dá);陰性對(duì)照組用攜帶無(wú)義基因序列的慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染陳骨細(xì)胞;空白對(duì)照組不加任何干預(yù)措施。采用半胱天冬酶3活性測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)及Tunel法評(píng)估ANXA1基因表達(dá)下調(diào)對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞的堿性磷酸酶染色陽(yáng)性率為（95.0±3.6）％，茜素紅染色呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。LV-shANXA1對(duì)成骨細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)的值為50。在感染復(fù)數(shù)為5

12、0時(shí)，LV-shANXA1對(duì)成骨細(xì)胞感染效率為（92.6±3.7）％。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)顯示感染復(fù)數(shù)為50時(shí)，LV-shANXA1對(duì)成骨細(xì)胞ANXA1基因的沉默效率效率可達(dá)70％以上。ANXA1表達(dá)下調(diào)后，成骨細(xì)胞半胱天冬酶3活性升高，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和Tunel法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率增加，均高于空白對(duì)照和陰性對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:慢病毒載體LV-shANXA1-901能有效沉默膜聯(lián)蛋白