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1、Vasostatin是一種新型的血管生成抑制因子,為鈣網(wǎng)素(Calreticulin)蛋白N′端結(jié)構(gòu)域片段第1-180個(gè)氨基酸,具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制血管生成的生物功能,其主要活性部位存在于第120-180個(gè)氨基酸片段中。為了確定vasosatatin蛋白的更短活性片段,本實(shí)驗(yàn)以含全長(zhǎng)人vasostatin蛋白cDNA序列的質(zhì)粒pUC18為模板,PCR擴(kuò)增四條不同長(zhǎng)度的vasostatin片段,分別插入到質(zhì)粒pGEX-4T-3的Ba
2、mH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)間,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/vasostatin-A、pGEX-4T-3/vasostatin-B、pGEX-4T-3/vasostatin-C以及pGEX-4T-3/vasostatin-A-C,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白表達(dá)。SDS-PAGE分析表明,表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在,改變誘導(dǎo)條件可增加可溶性表達(dá)量,包涵體形式的表達(dá)量約占菌全蛋白總量的55%。通過(guò)G
3、ST親和凝膠純化目的蛋白并用凝血酶(Thrombm)酶切后獲得單體vasostatin片段,采用MTT法檢測(cè)其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性,結(jié)果表明各GST-vasostatin及vasostatin片段具有程度不同的抑制bFGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性,其中以片段vasostatin-B(含氨基酸135-164)的抑制活性最為顯著??芍藇asostatin片段中的氨基酸135-164區(qū)域是活性較強(qiáng)的區(qū)域,為進(jìn)一步對(duì)其生物活性及作用機(jī)理的研究
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