賴型鉤端螺旋體致病相關(guān)基因invA的克隆、表達(dá)及其功能研究.pdf

1、鉤體為廣泛流行的人獸共患病—鉤體病的病原體。目前，對鉤體的致病及免疫分子機(jī)理的認(rèn)識不甚清楚。賴型鉤體56601株及哥本哈根株基因組測序表明，約60％的鉤體預(yù)測基因的功能未知。因此，鉤體的重要致病及免疫相關(guān)基因功能急需加強(qiáng)研究。 InvA基因存在于致病的賴型鉤體56601株及哥本哈根株中，信息分析表明，該基因與巴爾通體內(nèi)的與編碼侵襲能力相關(guān)蛋白IalA的基因等具有很高的相似性；以PCR擴(kuò)增試驗也證實，invA基因存在于強(qiáng)毒賴型鉤體

2、017株中，但不存在于無毒鉤體PatocⅠ株中。提示invA基因很可能為致病相關(guān)基因，同時，也很可能是一個免疫侯選基因及用于鉤體診斷的目的基因。 本研究選擇賴型鉤體017株中invA基因為目標(biāo)，PCR擴(kuò)增出含完整讀碼框的invA基因，與原核表達(dá)載體pET32a(+)連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pETINVA，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出分子量約為35kDa的InvA融合蛋白。InvA融合蛋白在菌體內(nèi)主要以可溶性方式表達(dá)，表達(dá)率約

3、占菌體總蛋白的50％。經(jīng)親和層析純化，獲得高純度的InvA融合蛋白。 進(jìn)一步探討InvA融合蛋白的致病及免疫功能。實驗中制備了抗InvA融合蛋白抗體。按200μg/kg量免疫新西蘭兔三次，ELISA法檢測血中抗體滴度達(dá)到1：32000，收集兔血清并以辛酸-硫酸銨法純化，獲得兔抗InvA融合蛋白抗體。WesternBlotting檢測抗體的反應(yīng)性，將純化的InvA融合蛋白、含pETINVA及pET32a(+)表達(dá)菌體蛋白電泳，轉(zhuǎn)印

4、至PVDF膜，以稀釋為1：10000兔抗InvA融合蛋白抗體為一抗，羊抗兔IgG為二抗，顯色結(jié)果表明呈現(xiàn)與InvA融合蛋白反應(yīng)的特異條帶，表明該抗體特異性好。但I(xiàn)nvA融合蛋白無刺激ANA-1細(xì)胞分泌IFN-γ的效應(yīng)，認(rèn)為InvA融合蛋白無細(xì)胞免疫的作用。 InvA蛋白的體內(nèi)、外功能作了較全面的研究。以InvA融合蛋白作用于ANA-1，SPC-A-1，A549和ECV304細(xì)胞，觀察該蛋白的細(xì)胞增殖效應(yīng)。結(jié)果顯示，InvA融合蛋

5、白有促進(jìn)ANA-1細(xì)胞增殖效應(yīng)，且該效應(yīng)隨著InvA融合蛋白濃度升高及作用時間的延長增殖作用越明顯。但I(xiàn)nvA融合蛋白對SPC-A-1，A549和ECV304細(xì)胞未產(chǎn)生明顯的促進(jìn)或抑制增殖效應(yīng)。 在進(jìn)行的細(xì)菌侵襲試驗中，將含pETINVA或pET32a(+)表達(dá)菌BL21(DE3)與人紅細(xì)胞作用，結(jié)果表明含pETINVA菌比pET32a(+)表達(dá)菌侵入紅細(xì)胞內(nèi)的數(shù)目顯著增多，說明InvA蛋白有助于細(xì)菌的侵襲。另外，構(gòu)建了大腸桿菌

6、-鉤體PatocⅠ株重組穿梭質(zhì)粒pGKINVA，電穿孔進(jìn)入鉤體PatocⅠ株中，篩選出含pGKINVA的重組鉤體菌株，將有利于深入探索該蛋白的致病功能。 本研究成功克隆了鉤體的invA基因，構(gòu)建pETINVA原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)了分子量約為35KDa的InvA融合蛋白，并純化出該蛋白。觀察到該蛋白促進(jìn)ANA-1細(xì)胞的增殖效應(yīng)，在表達(dá)菌BL21(DE3)中能顯著增強(qiáng)其細(xì)胞侵襲能力。制備的特異性抗InvA