IKBKE在人星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其抗星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤，由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)且與周圍腦組織邊界不清，運(yùn)用現(xiàn)代顯微外科技術(shù)、放療、化療等綜合治療措施后膠質(zhì)瘤患者預(yù)后依然不理想。闡述膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找特異性診斷和治療靶標(biāo)是目前膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。
　　 原癌基因的激活和抑癌基因的失活可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，尤其是許多激酶類的原癌基因的激活因?yàn)樵谌祟惸[瘤中起著必需的作用而引起廣泛關(guān)注。IKBKE和ILK均屬于絲氨酸/蘇氨

2、酸激酶家族的一員，其功能和作用機(jī)制尚未完全不清楚。目前尚未有IKBKE和ILK在星形細(xì)胞瘤方面的研究報(bào)道。
　　 第一部分、IKBKE和ILK在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)
　　 方法：1)采用Real time RT-PCR、western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)IKBKE和ILK在正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞及人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。2)收集4對(duì)臨床星形細(xì)胞瘤及腫瘤周邊正常腦組織，提取總蛋白和mRNA，采用Realtim

3、e RT-PCR和western blot方法檢測(cè)IKBKE和ILK的表達(dá)。3)對(duì)71例臨床星形細(xì)胞瘤和10例正常人腦組織石蠟標(biāo)本行SP免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)IKBKE蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS10.0進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.01)。4)對(duì)228例臨床星形細(xì)胞瘤和10例正常人腦組織石蠟標(biāo)本行SP免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)ILK蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS10.0進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.01)。
　　 結(jié)果：1)人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞

4、系中IKBKE和ILK mRNA和蛋白高表達(dá)，而在正常人星形細(xì)胞中IKBKE和ILK mRNA和蛋白低表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示IKBKE在正常人星形細(xì)胞中無明顯表達(dá)，在星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。2)人星形細(xì)胞瘤組織IKBKE和ILK mRNA和蛋白高表達(dá)，而在其對(duì)應(yīng)的瘤旁組織中IKBKE和ILKmRNA和蛋白低表達(dá)。3)免疫組化結(jié)果表明在星形細(xì)胞瘤組織中IKBKE定位于細(xì)胞漿，IKBKE在星形細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)并在正常腦組織中低表達(dá)

5、或不表達(dá)，星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中平均光密度值明顯高于正常腦組織標(biāo)本(p<0.01)；Spearman相關(guān)性分析顯示IKBKE的高表達(dá)與星形細(xì)胞瘤的病理分級(jí)無顯著性相關(guān)。4)免疫組化結(jié)果表明ILK在星形細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)并在正常腦組織中低表達(dá)，ILK高表達(dá)與星形細(xì)胞瘤的病理分級(jí)正相關(guān)，隨著ILK表達(dá)的增強(qiáng)，總體生存曲線有逐漸下降的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：
　　 1.正常人星形細(xì)胞中IKBKE和ILKmRNA和蛋白低表達(dá)，人星形細(xì)胞瘤

6、細(xì)胞系中IKBKE的mRNA和蛋白均有不同程度的高表達(dá)；
　　 2.人星形細(xì)胞瘤組織中IKBKE和ILK mRNA和蛋白表達(dá)水平均比瘤旁組織升高；
　　 3.IKBKE蛋白在正常腦組織中低表達(dá)或不表達(dá)，不同級(jí)別的星形細(xì)胞瘤IKBKE表達(dá)均顯著高于正常腦組織。IKBKE高表達(dá)與星形細(xì)胞瘤臨床分級(jí)二者之間無顯著性相關(guān)。
　　 4.ILK蛋白在正常腦組織中低表達(dá)或不表達(dá)，不同級(jí)別的星形細(xì)胞瘤ILK表達(dá)均顯著高于正常腦組

7、織。ILK高表達(dá)與星形細(xì)胞瘤臨床分級(jí)二者之間呈顯著性正相關(guān)，與患者的生存率負(fù)相關(guān)。
　　 第二部分、IKBKE異常表達(dá)對(duì)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響
　　 正常細(xì)胞的增殖、分化、凋亡受到一序列復(fù)雜基因群的嚴(yán)格調(diào)控，膠質(zhì)瘤療效不佳主要與下列因素有關(guān)：細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞抵抗凋亡、豐富的血管生成等，其中細(xì)胞增殖/凋亡的失衡可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生和難治的重要機(jī)制。研究表明抑制宮頸癌Hela細(xì)胞和有IKBKE擴(kuò)增的乳腺癌細(xì)胞系IKBKE的表

8、達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本部分旨在探討IKBKE表達(dá)上調(diào)和下調(diào)后對(duì)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：1)采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法將pBabe-Puro-Flag和pBabe-Puro-Flag-IKBKE分別轉(zhuǎn)染人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和LN-18，經(jīng)嘌呤霉素篩選，連續(xù)傳代，收集和抽提第5代細(xì)胞的總RNA和蛋白，經(jīng)定量Real time RT-PCR和Western Blot檢測(cè)IKBKE的表達(dá)。2)構(gòu)建3種pSUPER.r

9、etro.puro/IKBKERNAi，繼采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法將3種pSUPER.retro.puro/IKBKE RNAi和pSUPER.retro.puro分別轉(zhuǎn)染人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和LN-18，經(jīng)嘌呤霉素篩選，連續(xù)傳代，收集和抽提第5代細(xì)胞的總mRNA和蛋白，real timeRT-PCR和western blot檢測(cè)IKBKE的表達(dá)。3)adriamycin(0.1μM)誘導(dǎo)后Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)

10、記法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的凋亡；UV(40J/m2)誘導(dǎo)后TUNEL法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的凋亡；不同劑量的UV和不同濃度的adriamycin處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，通過活細(xì)胞計(jì)數(shù)、檢測(cè)Bcl-2和caspase-3變化以確定IKBKE對(duì)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：1) U87MG/pBabe-Puro-Flag-IKBKE和LN-18/pBabe-Puro-Flag-IKBKE細(xì)胞中IKBKE的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均明顯

11、高于對(duì)照組細(xì)胞U87MG和LN-18空載體。2)U87MG/pSUPER.retro.puro/RNAi和LN-18/pSUPER。retro.puro/RNAi細(xì)胞中IKBKE的表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均低于空載體對(duì)照組，其中LN-18/pSUPER.retro.puro[RNAil和LN-18/pSUPER.retro.puro/RNAi3細(xì)胞中IKBKE的表達(dá)量下降更明顯，U87MG/pSUPER.retro. puro/RNAi3

12、細(xì)胞中IKBKE的表達(dá)量下降更明顯，隨后的現(xiàn)象和作用機(jī)制的研究以這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系為研究對(duì)象。3)LN-18和U87MG/pBabe- Puro-Flag-IKBKE星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系與空載體Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記和TUNEL法結(jié)果對(duì)比顯示，后者細(xì)胞凋亡比例較高。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立外源性IKBKE高表達(dá)的人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和LN-18pBabe-Puro-Flag-IKBKE。<

13、br>　　 2.成功構(gòu)建了IKBKE RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和LN-18pSUPER.retro.puro/RNAi。
　　 3.IKBKE表達(dá)上調(diào)后U87MG和LN-18穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系抗凋亡能力增強(qiáng)，IKBKE表達(dá)下調(diào)后U87MG和LN-18穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系抗凋亡能力減弱。
　　 4.IKBKE表達(dá)下調(diào)后U87MG和LN-18穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系激活的Caspase-3增多，Bcl-2減少，細(xì)胞凋亡增多

14、；IKBKE表達(dá)上調(diào)后激活的Caspase-3減少，Bcl-2增多，細(xì)胞凋亡減少。
　　 第三部分、IKBKE異常表達(dá)對(duì)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡影響作用機(jī)制的研究
　　 IKK(IkB kinase)家族屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以磷酸化IkB，從而激活NF-kB通路，促進(jìn)NF-kB核移位。那么IKBKE作為IKK家族成員之一，其在星形細(xì)胞瘤中是否可以通過激活NF-kB通路的發(fā)揮抗凋亡作用？不同IKK家族成員可以作用于不同Ik

15、B家族成員，而后者決定了NF-kB激活后哪個(gè)/些家族成員發(fā)生核移位。IKBKE是否可以促進(jìn)某個(gè)NF-kB家族成員發(fā)生核移位亦是本部分將探討的內(nèi)容。
　　 方法：1)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NF-kB報(bào)告基因質(zhì)粒和pRL-TK，24h后檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性，所有的熒光素酶活性用Rellina活性正態(tài)化得到相對(duì)熒光素值，從而了解NF-kB啟動(dòng)子的活性。2)在IKBKE表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NF-k

16、B報(bào)告基因質(zhì)粒和突變型IKBα質(zhì)粒，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性，所有的熒光素酶活性用Rellina活性正態(tài)化得到相對(duì)熒光素值，從而了解NF-kB啟動(dòng)子的活性。3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系NF-kB家族成員之一--p50免疫熒光染色，觀察p50在細(xì)胞核和細(xì)胞漿的分布。4)提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白后用western blot法檢測(cè)p50的定位。
　　 結(jié)果：1)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NF-kB報(bào)告基因質(zhì)粒后顯示IKBK

17、E表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞系內(nèi)蛋白裂解物的相對(duì)熒光素值明顯高于其空載體對(duì)照組，IKBKE表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞內(nèi)蛋白裂解物的相對(duì)熒光素值顯著低于其空載體對(duì)照組。2)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NF-kB報(bào)告基因質(zhì)粒和突變型IKBα基因質(zhì)粒后顯示IKBKE表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系相對(duì)熒光素值顯著低于其空載體對(duì)照組。3)空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核和細(xì)胞漿均可見p50熒光染色，IKBKE表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核p50熒光染色明顯增強(qiáng)，細(xì)胞漿p50熒光染色減弱，IKBK

18、E表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核p50熒光染色顯著減弱。4)IKBKE表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核p50蛋白增多，細(xì)胞漿p50蛋白減少，IKBKE表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核p50蛋白減少，細(xì)胞漿p50蛋白增多。
　　 結(jié)論：
　　 1.人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞中IKBKE可通過磷酸化Ikα激活NF-kB通路。
　　 2.IKBKE可促進(jìn)NF-kB家族成員p50發(fā)生核移位，作用于其靶基因(如Bcl-2)從而發(fā)揮其抗星