鋅α-,2-糖蛋白對3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、目的： 肥胖已經(jīng)成為危害人類健康的全球性健康問題，與2型糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、部分腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新報道，全球肥胖及超重人口已達(dá)20億，到2015年預(yù)計該數(shù)字將增加到30億。肥胖是能量攝入與消耗平衡破壞的結(jié)果，而其核心的病理生理學(xué)機制則是脂肪細(xì)胞數(shù)量的不斷增加與體積的不斷增大使得體內(nèi)脂肪組織含量不斷增加，最終導(dǎo)致肥胖。上述過程通過前脂肪細(xì)胞的增殖與分化實現(xiàn)，因此對前脂肪細(xì)胞增殖與分化的

2、研究在肥胖發(fā)生機制的研究中具有舉足輕重的地位。鋅α2糖蛋白(ZAG)是近年來新發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子之一，最初在腫瘤惡液質(zhì)患者中發(fā)現(xiàn)該蛋白在惡液質(zhì)的發(fā)生中發(fā)揮一定作用。進一步的動物研究與體外細(xì)胞研究證實，ZAG具有強烈的促脂肪分解作用，提示該蛋白有望在肥胖治療中發(fā)揮一定的作用。然而，目前為止，尚無有關(guān)ZAG對前脂肪細(xì)胞增殖與分化影響的研究報道，我們試圖就ZAG對3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響展開研究。 為深入闡明ZAG對

3、3T3-L1細(xì)胞增殖與分化影響的可能機制，我們進一步選擇脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶：脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)與激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase，HSL)作為研究目標(biāo)，探討ZAG對FAS和HSL基因表達(dá)的影響。 方法： 1.利用陽離子脂質(zhì)體法向3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染mZAG表達(dá)質(zhì)粒(PcDNA3.1(-)-mZAG)，建立ZAG過表達(dá)的體外細(xì)胞培養(yǎng)

4、模型。 2.以MTr法觀察不同濃度mZAG表達(dá)轉(zhuǎn)染后不同時間，ZAG對3T3-L1細(xì)胞的增殖的影響。 3.采用含胰島素、地塞米松與IBMX的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化3T3-L1細(xì)胞，于分化不同階段向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染不同濃度mZAG表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后第二天，以油紅O染色與染料提取，以及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測定法測定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，從而觀察ZAG對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響。 4.分化不同階段向3T3-L1細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染不同濃度mZA

5、G表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后第二天收集細(xì)胞標(biāo)本，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR對細(xì)胞內(nèi)FAS與HSLmRNA表達(dá)水平進行檢測，以研究ZAG對FAS及HSLmRNA表達(dá)水平的影響。 5.分化不同階段向3T3-L1細(xì)胞內(nèi)同時轉(zhuǎn)染不同濃度mZAG表達(dá)質(zhì)粒與相同濃度分別含F(xiàn)AS與HSL基因啟動子序列的螢光素酶報告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后第二天采用雙螢光素酶報告基因監(jiān)測系統(tǒng)測定FAS與HSL基因啟動子活性，以研究ZAG對FAS及HS

6、L基因啟動子活性的影響。 結(jié)果： 1.ZAG對3T3-L1細(xì)胞的增殖具有刺激作用，該刺激作用具有劑量與時間依賴性，最大刺激作用發(fā)生與最高濃度轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后144小時，為對照組的143.4±12.1％(p<0.01)。 2.ZAG抑制3T3-L1細(xì)胞的分化，油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測定結(jié)果顯示，mZAG過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量相對于對照組顯著下降。 3.ZAG抑制FAS基因的表達(dá)。不同濃度mRNA質(zhì)粒于分化不

7、同時間轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)FAS mRNA表達(dá)水平相對于對照組均顯著下降，F(xiàn)AS啟動子活性也受到顯著抑制。 4.ZAG抑制HSL基因的表達(dá)。不同濃度mRNA質(zhì)粒于分化不同時間轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)HSL mRNA表達(dá)水平相對于對照組均顯著下降，HSL啟動子活性也受到顯著抑制。 結(jié)論： 本研究成功建立了ZAG過表達(dá)體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，并且以此為基礎(chǔ)，成為第一例探討ZAG對3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響的研究。結(jié)