銀杏葉提取物及其有效單體防治糖尿病腎病的作用及機制.pdf

1、目的:
　　 1. 建立銀杏葉提取物（GBE）血清藥理學研究方法；
　　 2. 采用該方法研究GBE含藥血清對腎小球系膜細胞（MC）的作用；
　　 3. 考察GBE中單體成分蘆丁和槲皮素對MC的作用。
　　 方法:
　　 第一部分：GBE血清藥理學方法的建立及其含藥血清對MC的作用
　　 1.含藥血清的制備：正常SD大鼠隨機分成正常對照組、GBE高劑量組、GBE中劑量組、GBE低劑量組。連

2、續(xù)給藥，每日2次，于末次給藥后采血。無菌條件下分離血清，濾過后凍存。
　　 2.大鼠MC的培養(yǎng)：大鼠MC分為正常對照組、空白血清組、高糖模型組、低、中、高劑量含藥血清組、GBE對照組，體外常規(guī)培養(yǎng)。
　　 3.MTT法確定體系中最佳空白血清添加量。
　　 4.HPLC法結合藥效法確定最宜采血時間。
　　 5.可見分光光度法測胞漿T-SOD、MDA、T-AOC三個抗氧化指標的水平。
　　 6.放射免

3、疫法測細胞漿內Ⅳ型膠原和層粘蛋白含量。
　　 7.RT-PCR法測細胞TGF-β1mRNA表達。
　　 8.HPLC法測GBE及其含藥血清指紋圖譜。
　　 第二部分：GBE單體有效成分對MC的作用
　　 1.大鼠腎小球系膜細胞的培養(yǎng)。大鼠MC分為正常對照組、溶劑對照組、高糖模型組、GBE對照組、卡托普利對照組、低、高劑量蘆丁組、低、高劑量槲皮素組。
　　 2.流式細胞術法測細胞周期。
　　

4、 3.放射免疫法測胞漿內Ⅳ型膠原和層粘蛋白含量。
　　 4.RT-PCR法測TGF-β1 mRNA表達。
　　 5.免疫印跡法測Smad2/3、Smad7蛋白含量。
　　 6.可見分光光度法測胞漿T-SOD、MDA兩個抗氧化指標的水平。
　　 結果:
　　 第一部分：GBE血清藥理學方法的建立及其含藥血清對MC的作用
　　 1.按人臨床用藥等效劑量的5倍，每日2次、連續(xù)4天灌胃給藥，于末次

5、給藥后2 h采血時大鼠血清中GBE各有效成分的含量最高。
　　 2.體系中加入20％該條件下制備的含藥血清對MC細胞正常增殖沒有影響。
　　 3.與高糖組相比，中、高劑量組含藥血清和GBE均可顯著提高MC的抗氧化水平。高劑量組含藥血清的抗氧化能力略好于GBE。
　　 4.與高糖組相比，GBE含藥血清中、高劑量組和GBE組的Ⅳ型膠原有顯著性下降；GBE高劑量含藥血清組和GBE組的Ⅳ型膠原的表達水平相當；GBE含藥血

6、清低中、高劑量組和GBE組的層粘蛋白有顯著性下降。
　　 5.與高糖組相比，GBE含藥血清中、高劑量組和GBE組TGF-β1含量明顯降低，有顯著性差異。表明GBE含藥血清可以降低TGF-β1的表達。
　　 6.在GBE及其含藥血清指紋圖譜中確定了蘆丁、槲皮素、槲皮苷和山奈酚四種單體成分，其中蘆丁和槲皮素是兩種主要成分。
　　 第二部分：GBE單體有效成分對MC的作用
　　 1.與高糖組相比，蘆丁低、高劑量

7、組和槲皮素低、高劑量組的G0/G1期均有顯著降低，不同劑量蘆丁組S期細胞比例有不同程度的升高；與正常組比較，槲皮素組S期細胞百分率降低，但G2/M期細胞比例增多，高劑量槲皮素可引起凋亡。
　　 2.與高糖組相比，蘆丁和槲皮素低、高劑量組均可降低細胞內Smad2/3蛋白的表達，增加細胞內Smad7蛋白的表達；蘆丁高劑量組和槲皮素低、高劑量組層粘蛋白和Ⅳ型膠原的表達有顯著性降低，與高糖組相比皆有顯著性差異；蘆丁和槲皮素低、高劑量組的