靶細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化篩選銀杏葉提取物防治糖尿病腎病的潛在活性成分.pdf

1、目的：利用液質(zhì)聯(lián)用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS)方法研究銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)經(jīng)正常及糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)病理狀態(tài)下的腎小球系膜細(xì)胞(Mesangial cell，MC)轉(zhuǎn)化后的量變及質(zhì)變規(guī)律，探尋GBE防治DN的潛在生物活性成分。
　　方法：在高糖狀態(tài)下建立腎小球系

2、膜細(xì)胞增殖病理模型。用傳代培養(yǎng)的大鼠MC同步化后分組:正常糖濃度組(NG組，5.56 mmol/L葡萄糖)、高糖組(HG組，25 mmol/L葡萄糖)、GBE正常糖組(GBE-NG組，10 mg/mL GBE-NG-DMEM)、GBE高糖組(GBE-HG組，10 mg/mLGBE-HG-DMEM)。建立靶細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，分別于細(xì)胞和藥物共培養(yǎng)4h，8h，12h，16h，24 h，48 h后分別收集MC培養(yǎng)基質(zhì)和細(xì)胞，利用LC-MS分別

3、對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)和細(xì)胞中的成分進(jìn)行定量和定性分析。色譜柱:Kromasil-C18色譜柱(4.6×250mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1％甲酸水溶液，線性梯度洗脫;流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4℃;進(jìn)樣量:10μL。柱后分流比1∶3進(jìn)入質(zhì)譜;ESI源;負(fù)離子模式檢測(cè);干燥氣溫度及流量:350℃，11 L/min;噴霧壓力:20 Psi;毛細(xì)管電壓:3000 V;碎片電壓:110V。采用對(duì)照品對(duì)照、文獻(xiàn)比對(duì)

4、的方法定性鑒別細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)及細(xì)胞中，GBE經(jīng)正常及高糖培養(yǎng)體系下MC不同時(shí)間生物轉(zhuǎn)化后的化學(xué)成分，尋找可能存在的特異性成分或代謝產(chǎn)物。定量分析采用MS的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reactionmonitoring，MRM）定量分析模式，定量測(cè)定GBE經(jīng)MC生物轉(zhuǎn)化后指標(biāo)性成分在細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)及細(xì)胞中的濃度。
　　結(jié)果：1.細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中GBE成分的定量及定性分析
　　高糖及正常狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中，48 h內(nèi)選定的任

5、何時(shí)間點(diǎn)均可以測(cè)到14種指標(biāo)性成分。和低糖組比較，在高糖環(huán)境下，GB、染料木素的Tmax明顯提前，提示細(xì)胞對(duì)這兩種物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化速度加快。正常及高糖培養(yǎng)的MC培養(yǎng)基質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)了40個(gè)共有原型成分和不同時(shí)間出現(xiàn)及消失的7個(gè)代謝產(chǎn)物，推測(cè)出2個(gè)代謝產(chǎn)物。
　　2.細(xì)胞中GBE成分的定量及定性
　　高糖培養(yǎng)體系下的細(xì)胞中，48 h內(nèi)選定的時(shí)間點(diǎn)均可以測(cè)到11種指標(biāo)性成分;高糖培養(yǎng)下，除蘆丁外，其他10種成分與細(xì)胞結(jié)合的達(dá)峰時(shí)間（T

6、max）均明顯推遲，尤其是GC、GB、BB、槲皮素、木犀草素、異鼠李素、山奈酚的Tmax均出現(xiàn)在培養(yǎng)48 h，槲皮苷及芫花素的Tmax推遲至24 h，芹菜素的Tmax推遲至12h;和正常糖組比較，細(xì)胞解離液中發(fā)現(xiàn)了19個(gè)GBE原型成分和5個(gè)代謝產(chǎn)物，推測(cè)出1個(gè)代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)論：高糖的存在顯著改變了GBE中化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化速度及與細(xì)胞結(jié)合的速度。高糖導(dǎo)致GBE的MC代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。高糖狀態(tài)下MC生物轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中出現(xiàn)的19個(gè)原型