大鼠雌性生殖干細(xì)胞建系、生物學(xué)特性研究與應(yīng)用.pdf

1、生殖發(fā)育是人類基本生命活動之一。長期以來,人們普遍接受出生后雌性哺乳動物的生殖細(xì)胞不具備增殖活性的觀點;直到近年,相繼揭示在成年小鼠與人卵巢中存在雌性生殖干細(xì)胞,才開始一個全新領(lǐng)域的研究。
　　在繼小鼠、人的卵巢中分離出雌性生殖干細(xì)胞之后,我們嘗試著對大鼠進行相應(yīng)的研究;本研究不僅為雌性生殖干細(xì)胞在哺乳動物中普遍存在提供證據(jù),同時,也為干細(xì)胞家族帶來新成員,為構(gòu)建大鼠轉(zhuǎn)基因模型提供新的技術(shù)路線。
　　本文首先對大鼠卵巢中Fr

2、agilis與DDX4的表達定位進行了比較,發(fā)現(xiàn)在卵巢皮質(zhì)處的相同類型細(xì)胞中這兩種蛋白均有表達;通過Fragilis/BrdU與DDX4/BrdU兩種雙熒光免疫標(biāo)記結(jié)合組織學(xué)定位,在5天齡與4-5周齡大鼠卵巢皮質(zhì)處均檢測到雙熒光信號即具有增殖活性的生殖細(xì)胞。對5天齡卵巢酶解后,使用Fragilis抗體對細(xì)胞懸液進行免疫磁珠分選,純化后進行體外培養(yǎng),成功建立SD大鼠雌性生殖干細(xì)胞系。
　　經(jīng)過對多種標(biāo)記基因、堿性磷酸酶、端粒酶、核型

3、與甲基化狀態(tài)等多種特征不同水平的鑒定,證實了該細(xì)胞系的生殖特性與干細(xì)胞特性,并在體內(nèi)與體外對該細(xì)胞系的功能進行了檢測。將該細(xì)胞系移植至不孕大鼠卵巢中,能恢復(fù)其生殖能力;通過這種方式成功建立了GFP轉(zhuǎn)基因大鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因大鼠,為構(gòu)建基因修飾大鼠模型提供了新方法。
　　另外,我們對fat-1轉(zhuǎn)基因大鼠的研究發(fā)現(xiàn),與fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠一樣,與野生型大鼠相比,組織中n-3脂肪酸含量和n-3與n-6脂肪酸比值均升高;老年 fat-1

4、轉(zhuǎn)基因大鼠與野生型大鼠相比,在血液學(xué)參數(shù)以及自主活動等方面均有顯著變化。我們認(rèn)為,這些特點能讓fat-1轉(zhuǎn)基因大鼠成為比fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠更顯優(yōu)勢的疾病研究模型,能應(yīng)用到生理活性與病理機制的探討研究中。
　　我們還嘗試對建立的細(xì)胞系進行體外誘導(dǎo)分化,經(jīng)過25天以上多階段不同條件培養(yǎng)及不同因子誘導(dǎo)后,發(fā)現(xiàn)該分化細(xì)胞進入減數(shù)分裂并形成卵母細(xì)胞透明帶以及卵母細(xì)胞所特有的GV結(jié)構(gòu)。這是首次應(yīng)用雌性生殖干細(xì)胞直接向卵母細(xì)胞誘導(dǎo)分化。雖然未