比格犬子宮與卵巢ERα、ERβ的表達(dá)及ERβ新剪接異構(gòu)體的研究.pdf

1、比格犬因其性情溫順,體格適中,遺傳背景清晰,均質(zhì)性好,在醫(yī)藥、公共衛(wèi)生、生命科學(xué)和軍事醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,發(fā)揮著重要的作用。但目前,我國(guó)比格犬種群內(nèi)的不發(fā)情或發(fā)情不孕、休情期延長(zhǎng)、停發(fā)情、窩產(chǎn)仔數(shù)少等情況比較常見(jiàn),嚴(yán)重制約著比格犬的生產(chǎn)效率,因此,針對(duì)比格犬生殖調(diào)控機(jī)理的研究具有重要的理論與實(shí)際意義。本研究對(duì)不同發(fā)情階段比格犬卵巢與子宮內(nèi)雌激素受體ERα、ERβ蛋白的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究,并對(duì)犬ERα、ERβ及可能存在的ERβ剪接異構(gòu)體進(jìn)行基因

2、擴(kuò)增,構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒,并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,對(duì)其活性進(jìn)行初步研究。突出的結(jié)果是首次發(fā)現(xiàn)了比格犬ERβ的四個(gè)剪接異構(gòu)體,為深入進(jìn)行比格犬ERα、ERβ及其剪接異構(gòu)體在生殖調(diào)控中的作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告如下。
　　1.間情期與發(fā)情期比格犬血清性激素檢測(cè)及卵巢與子宮正常組織形態(tài)的比較
　　應(yīng)用病理切片技術(shù)對(duì)間情期及發(fā)情期比格犬卵巢及子宮的正常組織形態(tài)進(jìn)行比較,并對(duì)兩個(gè)發(fā)情階段比格犬血清性激素:E2、PRG

3、E、FSH和LH水平進(jìn)行測(cè)定,分析其性激素變化特點(diǎn)和卵巢、子宮在不同階段的組織形態(tài)學(xué)特征。
　　性激素檢測(cè)結(jié)果表明:在發(fā)情期比格犬出現(xiàn)了很明顯的E2峰值,而在間情期及發(fā)情后期雌激素均維持在極低的水平。而PRGE在間情期未能檢測(cè)到,在發(fā)情期及發(fā)情后期均能檢出,并且在發(fā)情后期表達(dá)水平明顯升高。
　　組織形態(tài)學(xué)比較結(jié)果表明:間情期犬子宮及其內(nèi)膜較薄,間質(zhì)纖維增生,黃體中以初級(jí)卵泡為主,可見(jiàn)1-2個(gè)次級(jí)卵泡,未見(jiàn)成熟卵泡,卵泡和黃體

4、細(xì)胞間纖維較多、血管少。發(fā)情期犬子宮及其內(nèi)膜增厚,內(nèi)膜腺體腔較大,部分腺體呈分枝狀彎曲,腺上皮腫大,胞漿淡染,少數(shù)可見(jiàn)核下空泡。卵巢中卵泡數(shù)量較多,有初級(jí)、次級(jí)和1-2個(gè)成熟卵泡。黃體細(xì)胞數(shù)量多,排列規(guī)則,境界清楚,間質(zhì)纖維比較疏松,血管多,未見(jiàn)空泡變性。
　　2.間情期與發(fā)情期比格犬卵巢與子宮內(nèi)ERα、ERβ的定位與定量研究
　　運(yùn)用免疫組織化學(xué)和圖像灰度分析法對(duì)間情期與發(fā)情期比格犬卵巢及子宮內(nèi)ERα、ERβ蛋白的表達(dá)進(jìn)行

5、組織定位和半定量分析,結(jié)果如下:
　　(1)比格犬ERα、ERβ的免疫組織化學(xué)定位
　　ERα主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞、卵巢間質(zhì)腺腺上皮細(xì)胞胞核內(nèi),胞質(zhì)內(nèi)有微弱表達(dá),卵母細(xì)胞胞核及卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá),在卵泡膜內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞及小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。在膜黃體細(xì)胞的胞核,顆粒黃體細(xì)胞的胞核與胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)。
　　ERβ主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞,卵巢間質(zhì)腺的腺上皮細(xì)胞及顆粒黃體細(xì)胞

6、的核膜及胞質(zhì)內(nèi),少量表達(dá)于卵巢間質(zhì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的核膜及胞質(zhì)內(nèi)。
　　ERα主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞胞核內(nèi),而ERβ主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞核膜及胞質(zhì),在血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)。
　　BCIP/NBT與AEC雙染可見(jiàn)ERα、ERβ在子宮內(nèi)可表達(dá)于同一個(gè)內(nèi)膜腺體細(xì)胞,但其定位部位不同:ERα主要在核內(nèi),而ERβ主要在核膜及胞質(zhì)內(nèi)。
　　(2)ERα、ERβ半定量分析結(jié)果

7、r>　　間情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)各組成成份ERα蛋白的表達(dá)特點(diǎn):間情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)腺體、卵泡及周圍基質(zhì)、黃體各組份ERα表達(dá)的變化以腺體(0.03297±0.004075 vs 0.06647±0.008961,P<0.01)和黃體(0.01286±0.003219 vs 0.06241±0.007671,P<0.01)為顯著,在發(fā)情期的表達(dá)水平均較間情期顯著增加。表明ERα蛋白主要表達(dá)于發(fā)情期卵巢腺體及黃體內(nèi)。
　　間

8、情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)各組成成份ERβ蛋白的表達(dá)特點(diǎn):由間情期發(fā)展至發(fā)情期,比格犬卵巢生長(zhǎng)卵泡、初級(jí)卵泡、黃體、間質(zhì)血管各組份中,生長(zhǎng)卵泡ERβ表達(dá)水平顯著增加(0.04471±0.004291 vs 0.1300±0.03970,P<0.01),黃體內(nèi)ERβ表達(dá)水平顯著下降(0.1515±0.02711 vs 0.1008±0.02247,P<0.01),但黃體內(nèi)ERβ的起始表達(dá)水平很高,與初級(jí)卵泡及間質(zhì)血管中的表達(dá)水平(0.018

9、79±0.001484)比較仍保持在較高的水平。初級(jí)卵泡及卵巢間質(zhì)血管中ERβ保持在相對(duì)較低的水平。表明在卵巢內(nèi)ERβ蛋白主要表達(dá)于生長(zhǎng)卵泡及黃體內(nèi)。
　　間情期與發(fā)情期比格犬ERα、ERβ蛋白在卵巢內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn):在間情期及發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)ERβ的表達(dá)水平顯著高于ERα(間情期:0.08646±0.008002 vs 0.02398±0.001911,P<0.01;發(fā)情期:0.09007±0.007534 vs 0.04691±

10、0.003052,P<0.01)比格犬卵巢內(nèi)ERα在由間情期發(fā)展至發(fā)情期時(shí)表達(dá)水平顯著增加(0.02398±0.001911 vs 0.04691±0.003052,P<0.01),而ERβ在兩個(gè)生理階段基本保持不變(0.08646±0.008002 vs 0.09007±0.007534,P>0.05),但與ERα比較,維持在較高的表達(dá)水平。說(shuō)明在間情期與發(fā)情期卵巢內(nèi)均以ERβ的表達(dá)占主導(dǎo)地位。
　　間情期與發(fā)情期比格犬ERα、

11、ERβ蛋白在子宮內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn):在比格犬子宮內(nèi),在間情期,ERα、ERβ都有表達(dá),但都維持在相對(duì)較低的水平,并且兩者的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(0.02855±0.008855 vs 0.02908±0.003865,P>0.05),而發(fā)展至發(fā)情期時(shí),ERα的表達(dá)水平顯著增加(0.02855±0.008855 vs 0.04896±0.006833,P<0.01),ERβ仍維持在相對(duì)較低的水平(0.02170±0.003959)。由此得出結(jié)論在

12、發(fā)情期比格犬子宮內(nèi),ERα為優(yōu)勢(shì)表達(dá)的雌激素受體亞型。
　　3.ERα、ERβ及ERβ新剪接異構(gòu)體的擴(kuò)增與鑒定
　　應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增了ERα和ERβ的全長(zhǎng)編碼序列:ERα1791和ERβ1593,并首次篩選出了ERβ的四個(gè)選擇性剪接異構(gòu)體:第4外顯子完整缺失的一個(gè);第7外顯子完整缺失的一個(gè);部分第4和部分第5外顯子組合缺失的兩個(gè)。應(yīng)用5`3`RACE對(duì)第4外顯子完整缺失的ERβ1293及第7外顯子完整缺失的ERβ1257

13、兩個(gè)剪接異構(gòu)體擴(kuò)增出其全長(zhǎng)編碼序列。ERα1791分子量為66kD,ERβ1593分子量為59kD;ERβ1293缺失300bp,編碼430aa,分子量為48kD;ERβ1257缺失181bp,編碼418aa,分子量為47kD,堿基的缺失造成了讀碼移位,使翻譯提前終止,在其終止密碼子前插入10個(gè)非編碼ERβ氨基酸殘基。訖今,我們尚未查到關(guān)于比格犬ERβ的剪接異構(gòu)體的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)比格犬ERβ的四個(gè)剪接異構(gòu)體,擴(kuò)增出其中兩個(gè)的全

14、長(zhǎng)編碼序列,并且證明其在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中能夠翻譯成蛋白質(zhì)。
　　4.ERα、ERβ及ERβ剪接異構(gòu)體真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及活性的初步研究
　　構(gòu)建了pEGFP-n1-ERα1788,pEGFP-n1-ERβ1590,pEGFP-n1-ERβ1290,pEGFP-n1-ERβ1254真核表達(dá)重組質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)WB驗(yàn)證ERα1788、ERβ1590、ERβ1290、ERβ1254在體外均