埃他卡林對(duì)重要器官心腦肝基因表達(dá)的影響.pdf

1、埃他卡林(iptakalim，Ipt)是軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所自行合成的一類具有新化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的抗高血壓藥物，具有開(kāi)放ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitivepotassiumchannel，KATP)引起血壓降低的新型藥理學(xué)作用機(jī)制。在治療學(xué)方面，埃他卡林降壓作用平穩(wěn)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)心率的影響輕，同時(shí)埃他卡林具有逆轉(zhuǎn)高血壓心血管重構(gòu)的作用，對(duì)高血壓所引起腦損害、腎損害均有保護(hù)作用，是一類具有臨床應(yīng)用前景的抗高血壓藥物。本研

2、究室前期工作對(duì)該化合物的作用機(jī)制、作用特點(diǎn)以及藥物作用譜已有廣泛深入的研究，但是該化合物作用后對(duì)體內(nèi)重要的基因和蛋白有何影響目前尚不清楚，而認(rèn)識(shí)該問(wèn)題對(duì)于我們?nèi)胬斫獍Ｋ值寞熜б约邦A(yù)測(cè)不良反應(yīng)具有重要意義。 基因芯片技術(shù)具有高通量、快速、高效、平行性和全面等特點(diǎn)，能全面闡述藥物在體內(nèi)的生物學(xué)特點(diǎn)，為全面研究藥物的療效以及不良反應(yīng)提供了技術(shù)平臺(tái)。因此本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片技術(shù)，觀察埃他卡林對(duì)重要器官心、肝和腦組織在基因表達(dá)水平的影

3、響，初步判斷埃他卡林的基因作用譜，為進(jìn)一步闡述埃他卡林的體內(nèi)生物學(xué)作用特征提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)以心臟組織為重點(diǎn)，從功能上觀察埃他卡林用藥對(duì)心功能的影響，為評(píng)價(jià)長(zhǎng)期服藥安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、埃他卡林對(duì)大鼠心臟組織基因表達(dá)的影響1.埃他卡林對(duì)大鼠心臟組織差異表達(dá)的基因采用的BioStarR40scDNA芯片涵蓋大鼠基因組中4096個(gè)具有重要功能的基因序列，檢測(cè)經(jīng)埃他卡林3mg/kgpo2周處理后的大鼠心臟組織基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明，

4、心臟組織差異表達(dá)的基因共有236條，其中100個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，136個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。埃他卡林調(diào)節(jié)心臟組織的基因表達(dá)包括與肌肉收縮相關(guān)的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白等；與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的G蛋白、腺苷酸環(huán)化酶和鈣調(diào)結(jié)合蛋白等。 2.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法驗(yàn)證心臟差異表達(dá)基因采用RT-PCR技術(shù)，選取部分上述差異表達(dá)的基因?qū)π酒瑢?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明：肌球蛋白調(diào)控輕鏈、ADP-核糖基因子1、ADP-核糖基因子4、

5、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(Gs)、腺苷酸環(huán)化酶(AC)表達(dá)增加，蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白磷酸酶2基因表達(dá)減少，與芯片結(jié)果一致。 3.埃他卡林對(duì)大鼠心臟蛋白激酶A(PKA)活性的影響采用非放射性標(biāo)記方法檢測(cè)蛋白激酶A的活性，發(fā)現(xiàn)埃他卡林可使PKA的活性升高76％(P＜0.05)。 4.埃他卡林對(duì)麻醉大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(生理鹽水組)，埃他卡林1、3和9mg/kg組，第5組給埃他卡林9m

6、g/kg但用藥結(jié)束后停藥10天(9mg/kg撤藥組)。灌胃，兩周。觀察最后一次給藥24小時(shí)后麻醉大鼠血流動(dòng)力學(xué)的改變。 采用直接插管法，觀測(cè)麻醉大鼠的血壓(SBP、DBP、MAP)、心率(HR)和收縮功能參數(shù)(LVSP、+dp/dtmax、Vpm)以及舒張功能參數(shù)(-dp/dtmax、-dp/dtmaxTime)指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，埃他卡林1、3、9mg/kg組及9mg/kg撤藥組對(duì)心率、收縮壓、舒張壓以及平均動(dòng)脈壓、收縮功能

7、及舒張功能均無(wú)明顯影響(P＞0.05)。 5.埃他卡林對(duì)大鼠離體工作心臟功能的影響離體工作心臟因不受神經(jīng)、體液及外周阻力等調(diào)節(jié)因素的影響，可用于研究藥物對(duì)心臟的直接作用，本實(shí)驗(yàn)灌胃給予埃他卡林2周，在最后一次給藥24小時(shí)后取其心臟，分別觀察其對(duì)正性肌力藥異丙腎上腺素(Iso)及負(fù)性肌力藥吡那地爾(Pin)的反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明異丙腎上腺素10nmol/L具有正性頻率以及正性肌力的作用，埃他卡林1、3、9mg/kg組及9m

8、g/kg撤藥組的離體工作心臟，對(duì)異丙腎上腺素(10nmol/L)灌流10min的反應(yīng)特征一致，即與正常對(duì)照組相比，對(duì)各心功能指標(biāo)均無(wú)顯著的影響。吡那地爾10μmol/L具有正性頻率以及負(fù)性肌力的作用。埃他卡林1、3、9mg/kg組及9mg/kg撤藥組的離體工作心臟，對(duì)吡那地爾(10μmol/L)灌流10min的反應(yīng)特征一致，即與正常對(duì)照組相比，對(duì)各心功能指標(biāo)均無(wú)顯著的影響。結(jié)果提示心肌對(duì)腎上腺素受體激動(dòng)劑(異丙腎上腺素)和鉀通道開(kāi)放劑(

9、吡那地爾)的心臟藥理學(xué)反應(yīng)無(wú)顯著變化。 6.埃他卡林對(duì)心臟組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的影響從組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察埃他卡林對(duì)大鼠心肌組織的影響，結(jié)果表明，埃他卡林1、3、9mg/kg組及9mg/kg撤藥組對(duì)大鼠心肌組織學(xué)無(wú)病理學(xué)意義的變化，即心肌纖維排列整齊、致密；埃他卡林1、3、9mg/kg組及9mg/kg撤藥組對(duì)大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)無(wú)病理學(xué)意義的變化，即肌纖維排列規(guī)整，線粒體結(jié)構(gòu)完整。 二、埃他卡林對(duì)大鼠肝臟組織基因表達(dá)的影

10、響采用BioStarR40scDNA芯片檢測(cè)經(jīng)埃他卡林3mg/kg2周處理后的大鼠肝臟組織基因表達(dá)的變化，肝臟組織發(fā)現(xiàn)6個(gè)表達(dá)差異的基因，表達(dá)均上調(diào)，包括CYP4a10、CYPgb1、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶、烯酰CoA水化酶、EST197129、n0002e06。采用RT-PCR方法對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CYP4a10、CYP8b1、烯酰CoA水化酶表達(dá)上調(diào)，與芯片結(jié)果一致。 三、埃他卡林對(duì)大鼠腦組織基因表達(dá)的影響采用BioStar

11、R40scDNA芯片檢測(cè)經(jīng)埃他卡林3mg/kg2周處理后的大鼠腦組織基因表達(dá)的變化，芯片結(jié)果表明：該實(shí)驗(yàn)體系下埃他卡林對(duì)正常腦組織基因表達(dá)無(wú)影響。 綜上所述，本研究結(jié)論如下：1.全新結(jié)構(gòu)的化合物埃他卡林對(duì)重要器官心、腦和肝臟基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用具有選擇性。采用4096個(gè)具有重要功能的基因序列的芯片，埃他卡林3mg/kgpo2周，大鼠心臟236個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化，其中100個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，136個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；肝臟6個(gè)基因表達(dá)上調(diào)

12、；腦組織的基因表達(dá)未發(fā)生變化。 2.埃他卡林調(diào)節(jié)心臟組織的基因表達(dá)包括與肌肉收縮相關(guān)的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白等；與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的G蛋白、腺苷酸環(huán)化酶和鈣調(diào)結(jié)合蛋白等。 3.反復(fù)給予埃他卡林可增加心肌PKA活性。 4.埃他卡林1、3、9mg/kgpo2周，最后一次給藥24小時(shí)后，在體心臟功能未發(fā)現(xiàn)有藥理學(xué)意義的變化；也未發(fā)現(xiàn)心肌組織及其超微結(jié)構(gòu)有病理學(xué)意義的變化；心肌對(duì)腎上腺素受體激動(dòng)劑(異丙腎上腺素)和鉀通