新型K-,ATP-開放劑埃他卡林對(duì)人肺動(dòng)脈收縮與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、缺氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)作為一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，是慢性阻塞性肺病(Chronicobstructive pulmonary disease，COPD)的重要病理生理過程，也是發(fā)展為慢性肺源性心臟病(Chronic cor pulmona1e)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。盡管在過去的十多年中，應(yīng)用前列環(huán)素類藥物、磷酸二酯酶-5抑制劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑治療肺動(dòng)脈高壓已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展

2、，但由于對(duì)HPH的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因而這些治療并未從根本上治療肺動(dòng)脈高壓。因此，對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓形成機(jī)制的研究并研發(fā)有效的針對(duì)致病靶標(biāo)的防治藥物顯得尤為必要。 近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到肺血管平滑肌細(xì)胞鉀通道在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展中的作用。鉀通道功能下降，細(xì)胞內(nèi)K+外流減少，細(xì)胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道開放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加，肺血管平滑肌細(xì)胞收縮、增殖，肺動(dòng)脈壓

3、增高；另一方面肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鉀通道功能下降，細(xì)胞內(nèi)K+增多，細(xì)胞凋亡減少，進(jìn)一步加重肺血管重構(gòu)。有鑒于此，鉀通道開放劑對(duì)肺動(dòng)脈高壓的防治成為近年來國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。 肺血管平滑肌細(xì)胞至少存在三種類型鉀通道：(1)電壓依賴性鉀(Kv)通道，(2)Ca2+激活性鉀(Kca)通道，(3)ATP敏感性鉀(KATP)通道。細(xì)胞膜KATP通道是目前已知的唯一的可在機(jī)體缺血、缺氧等病理生理情況下代償性開放的鉀通道，是機(jī)體對(duì)抗缺血缺氧的

4、重要自身保護(hù)機(jī)制，已經(jīng)成為研發(fā)新型治療肺動(dòng)脈高壓藥物的重要靶標(biāo)。 由于KATP通道調(diào)控人類肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮、增殖的細(xì)胞信號(hào)及分子機(jī)制尚不明確，本文從器官、細(xì)胞和分子水平探討KATP通道調(diào)控人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮、增殖的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制，系統(tǒng)評(píng)價(jià)我國(guó)學(xué)者自行研制的新型KATP開放劑埃他卡林(Iptakalim，IPT)對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮和增殖的影響，為研究開發(fā)新型治療肺動(dòng)脈高壓的藥物提供理論依據(jù)。本文主要圍繞如下三個(gè)

5、部分開展工作： 第一部分新型KATP開放劑埃他卡林對(duì)ET-1誘導(dǎo)的離體人肺動(dòng)脈環(huán)收縮的影響 目的：研究IPT對(duì)內(nèi)皮素-1(ET-1)誘導(dǎo)的人離體肺動(dòng)脈環(huán)收縮的影響及其機(jī)制。 方法：分離正常離體人肺動(dòng)脈條，置于含飽和混合氧(95％O2和5％CO2混合氣)和Krebs-Henseleit(K-H)液(含mol·L-1：NaCl 119，KC14.7，MgSO4 0.6，NaHCO3 25，KH2PO4 1.2，CaCl

6、2 2.5和葡萄糖11.1，PH 7.4)的培養(yǎng)皿內(nèi)，剪取3 mm長(zhǎng)的血管環(huán)固定于含K-H液的浴槽內(nèi)，持續(xù)小流量通入混合氧，靜息張力下穩(wěn)定60 min后，通過張力換能器與十六道生理記錄儀相連，記錄血管環(huán)的張力變化。按累積法給予7個(gè)濃度ET-100.05～50 nmol·L-1)，觀察ET-1收縮血管作用的量效關(guān)系，求出EC50；觀察ET-1在EC50濃度的時(shí)效曲線。在此基礎(chǔ)上，以ET-1的EC50濃度使肺動(dòng)脈環(huán)達(dá)到最大收縮幅度時(shí)，按累積

7、法加入IPT1.0-13～10-3mol·L-1或Pin10-13～10-3mol·L-1，以等容量溶劑做陰性對(duì)照，記錄肺血管環(huán)收縮張力的變化，并以ET-1最大收縮幅度為100％，計(jì)算IPT和Pin的舒張率。 結(jié)果：在0.05～50nmol·L-1濃度范圍內(nèi)，ET-1呈濃度依賴性地誘導(dǎo)離體人肺動(dòng)脈環(huán)收縮，其Ec50±L95為10.19±1.26 nmol·L-1，6士Sb為0.905±0.186，r=0.91。在10-13～10

8、-3 nmol·L-1濃度時(shí)，IPT呈濃度依賴地拮抗ET-1誘導(dǎo)的離體人肺動(dòng)脈環(huán)收縮，其IC50為27.11 nmol·L-1；Pin同樣也呈濃度依賴性拮抗ET-1 10nmol·L-1誘導(dǎo)的動(dòng)脈收縮，與IPT組比較，二者無顯著}生差異(P>0.05)。 結(jié)論： IPT可拮抗ET-1誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈環(huán)收縮，其機(jī)制可能在于開放肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的KATP通道。IPT可以有效舒張人肺動(dòng)脈，表明其是一個(gè)富有潛力的治療肺動(dòng)脈高壓的候選藥物

9、。 第二部分新型KATP開放劑埃他卡林對(duì)ET-1誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響 目的：研究IPT對(duì)ET-1誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。 方法：以原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，用ET-1誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)摻入法檢測(cè)脫氧核糖核苷酸(DNA)合成；流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期。 結(jié)果： ET-1(10

10、 nM)使原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞[3H]-TdR摻入量增加，促進(jìn)細(xì)胞由靜止期(G0/G1期)進(jìn)入DNA合成期(S期)和有絲分裂期(G2/M期)；IPT呈濃度依賴性抑制ET-1誘導(dǎo)的[3H]-TdR摻入量增多，阻止人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞由靜止期(G0/G1期)進(jìn)入DNA合成期(S期)和有絲分裂期(G2/M期)；Pin同樣抑制ET-1誘導(dǎo)的[3H]-TdR摻入量增多和細(xì)胞周期的改變，且與IPT比較二者無顯著差異；格列本脲呈濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)

11、IPT與Pin對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。 結(jié)論：IPT作為一種新型的KATP開放劑，可以抑制人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，是一種治療肺動(dòng)脈高壓的侯選藥物。 第三部分新型KATP開放劑埃他卡林對(duì)ET-1誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt及ERK1/2磷酸化的影響 目的：研究IPT對(duì)ET-1誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度([Ca2+]cyt)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)磷酸化的影

12、響及其機(jī)制。 方法：以原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，分別用ET-1與IPT處理人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt變化；使用westem blot檢測(cè)ERK1/2磷酸化水平的改變。 結(jié)果：ET-1誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+顯著增加，IPT(10μM)拮抗ET-1誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt升高；ET-1促使人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的ERK1/2磷酸化，且

13、磷酸化ERK1/2水平在加入ET-1后10 min達(dá)高峰，IPT呈濃度依賴性抑制ET-1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的ERK1/2磷酸化。 結(jié)論：IPT作為一種特異性KATP開放劑，可能通過增強(qiáng)KATP通道的功能與通道蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+減少，進(jìn)而抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的活化，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌舒張并抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。 綜合本文三個(gè)部分的研究結(jié)果，獲得如下結(jié)論： 1.IPT通過開放肺動(dòng)脈

14、平滑肌細(xì)胞上的KATP通道，拮抗ET-1誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈環(huán)收縮，有效舒張人肺血管； 2.IPT抑制細(xì)胞DNA合成，阻止細(xì)胞由靜止期(G0/G1期)進(jìn)入DNA合成期(S期)和有絲分裂期(G2/M期)，抑制人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖； 3.IPT通過增強(qiáng)KATP通道的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+減少，進(jìn)而抑制ERK1/2的磷酸化。 4.總之，新型KATp開放劑IPT在整體、細(xì)胞、分子水平抑制人肺動(dòng)脈環(huán)的收縮與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)