水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變基因gry79的圖位克隆.pdf

1、水稻（Oryza sativa）是我國(guó)重要的糧食作物之一，也是研究植物功能基因組學(xué)的單子葉模式植物。而葉色突變是水稻中比較常見(jiàn)的一種突變類(lèi)型，在研究植物光合作用的生理生化機(jī)制、水稻基因功能以及遺傳育種應(yīng)用等各方面都具有重要的價(jià)值。為了明確水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79(green-revertibleyellow79)的表型特征和遺傳特性以及突變基因的功能，本研究對(duì)該突變材料進(jìn)行了表型特征的調(diào)查、主要農(nóng)藝性狀的調(diào)查和葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察，

2、并對(duì)突變基因進(jìn)行了分子標(biāo)記定位、圖位克隆、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證、熒光定量等分析。主要研究結(jié)果如下:
　　利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)對(duì)粳稻日本晴的一個(gè)遲熟突變體lvp1進(jìn)行誘變，得到一個(gè)黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79，該突變體在三葉期以前表現(xiàn)為黃綠葉，第四葉開(kāi)始逐漸轉(zhuǎn)綠，六葉期以后恢復(fù)到正常綠色。盡管突變體gry79植株在苗期生長(zhǎng)緩慢，但它的抽穗期比野生型親本(lvp1)推遲僅1.4d。在成熟期，除

3、了每株有效穗數(shù)比野生型下降15.2％外，突變體的株高、每穗著粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重與野生型差異并不顯著。光合色素含量的測(cè)定結(jié)果顯示，gry79突變體在三葉期的Chla、Chlb、總Chls含量和類(lèi)胡蘿卜素分別減少了76.4％、76.9％、76.5％和58.1％。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，野生型中的葉綠體有著發(fā)育完整的由基粒組成的膜系統(tǒng)，而gry79突變體的葉綠體中的基粒松散并且類(lèi)囊體膜發(fā)育不完善，并且葉綠體所含淀粉粒較少，表明突變體的葉綠體

4、的發(fā)育在幼苗早期受到抑制。
　　遺傳分析表明該黃化轉(zhuǎn)綠突變性狀是受一對(duì)隱性核基因控制的。以gry79突變體與正常綠葉表型的浙輻802雜交得到的F2代作為定位群體，將gry79突變基因精細(xì)定位于水稻第2染色體長(zhǎng)臂上的InDel標(biāo)記W4與W5之間的71kb染色體區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域含有8個(gè)預(yù)測(cè)基因。從gry79突變體及野生型親本中分別擴(kuò)增出這8個(gè)預(yù)測(cè)基因并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示gry79突變體內(nèi)僅Os02g33610發(fā)生了突變，其余7個(gè)基因均未

5、見(jiàn)突變。Os02g33610基因全長(zhǎng)7492bp，有17個(gè)內(nèi)含子和18個(gè)外顯子，CDS全長(zhǎng)長(zhǎng)2616bp，編碼一個(gè)含871個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。在gry79突變體中，該基因序列在第4209位堿基（位于第11外顯子）由C突變成T，使CDS第1160位堿基由C突變成T,導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)第387位氨基酸由絲氨酸（Ser或S）突變成苯丙氨酸(Phe或F)。因此將該基因確定為引起gry79黃化突變的候選基因，暫命名為GRY79基因。
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6、基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果顯示GRY79是一個(gè)單考貝基因，編碼一個(gè)分子量約96 kDa的蛋白質(zhì)。GRY79蛋白在N-端含有一個(gè)由36個(gè)氨基酸殘基組成的葉綠體靶序列，同時(shí)該蛋白質(zhì)還在N-端含有一個(gè)由202個(gè)氨基酸殘基組成的金屬-β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)域(metallo-β-lactamase domain)，在C-端含有一個(gè)由66個(gè)氨基酸殘基組成的三螺旋DNA結(jié)合域(trihelix DNA binding domain)。多氨基酸序列比對(duì)顯示，GRY

7、79蛋白與高梁(Sorghum bicolor)和谷子（Setaria italica）的假定蛋白的同源性最高。此外，分析了GRY79蛋白與高等植物和其它光合生物中的同源蛋白的可能進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明GRY79與單子葉植物高梁和谷子的同源蛋白有更近的進(jìn)化關(guān)系。
　　進(jìn)一步做了轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因株系在幼苗期跟野生型親本一樣呈綠色表型，進(jìn)一步檢測(cè)葉片光合色素含量，結(jié)果表明其葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量恢復(fù)到了野生型親本的水平，表明野生型G

8、RY79(Os02g33610)基因互補(bǔ)了gry79突變體表型，證明該突變體表型是由Os02g33610基因序列的單堿基突變引起的。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，GRY79在gry79突變體兩葉期和三葉期葉片中的表達(dá)水平比在野生型中低得多。隨后，GRY79在gry79突變體葉片中的表達(dá)逐漸升高，并在九葉期葉片中接近野生型的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明了GRY79基因在gry79突變體的最初幾片葉子中表達(dá)量很低，這個(gè)結(jié)果與突變體在苗期