高親和力ABLSH3片段競爭性結(jié)合RIN1抑制BCR-ABL活性和增加伊馬替尼敏感性的研究.pdf

1、Bcr-Abl融合蛋白具有異常激活的酪氨酸激酶活性，是慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic myelogenous leukemia，CML）的典型標(biāo)志，位于Abl段的SH3結(jié)構(gòu)與Bcr-Abl蛋白激酶活性激活有著直接的關(guān)系，可負(fù)向調(diào)控Bcr-Abl的活性，其關(guān)鍵位點(diǎn)的突變或結(jié)合配體的改變均可引起伊馬替尼（Imatinib，IM）耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)耐 IM慢粒細(xì)胞株 KCL22高表達(dá)RIN1蛋白，而對(duì)IM敏感的細(xì)胞株中RIN1表達(dá)較低。RIN

2、1是作為Abl的一個(gè)直接的激活因子控制對(duì)IM敏感的調(diào)定點(diǎn)。RIN1是Ras抑制因子1，含Abl結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Abl binding domain，ABD）。RIN1富含脯氨酸的序列（PPAVPPPPVP）通過與Abl的SH3（PxxP motif）低親和力的結(jié)合引起 RIN1 Tyr36的磷酸化，隨后和 SH2作用，導(dǎo)致Abl構(gòu)象的改變，自抑制結(jié)構(gòu)被解除，激活Bcr-Abl，繼而促進(jìn)Abl底物的磷酸化，而對(duì)Bcr-Abl蛋白的表達(dá)無影響，

3、并且這種作用不依賴于SRC介導(dǎo)的Abl酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（TKD）磷酸化活性，亦不受Bcr-Abl T315I突變的影響。因此，RIN1已經(jīng)成為IM耐藥的研究熱點(diǎn)之一。
　　本課題嘗試采用直接阻滯Bcr-Abl與RIN1兩者之間作用的策略，通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，篩選Abl SH3與RIN1 ABD結(jié)合的最佳片段，并在保持其高度特異性的前提下，將Abl SH3結(jié)構(gòu)突變，使RIN1與Bcr-Abl SH3結(jié)構(gòu)的低親和力結(jié)合方式轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和

4、力。通過構(gòu)建突變體重組腺病毒載體，分別選取高表達(dá)和低表達(dá) RIN1的細(xì)胞株 KCL22（耐IM細(xì)胞株）和K562及IM耐藥的K562/G01為模型，研究其在細(xì)胞內(nèi)是否通過競爭性結(jié)合的方式與RIN1相結(jié)合從而調(diào)控Bcr-Abl酪氨酸激酶活性，同時(shí)聯(lián)合 IM用藥，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討高親和力的Abl SH3對(duì)CML細(xì)胞株的影響及相關(guān)的作用機(jī)制。旨在為CML聯(lián)合用藥和耐藥治療奠定基礎(chǔ)。
　　采用的主要實(shí)驗(yàn)方法如下：
　　1.利用分子

5、動(dòng)態(tài)模擬和計(jì)算機(jī)分子模擬軟件找出Abl SH3片段與RIN1富含脯氨酸區(qū)域結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，突變單/兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)或改變序列長度，NAMD2.8軟件Amber力場下動(dòng)力學(xué)模擬突變后的結(jié)構(gòu)，PepSite2.0軟件預(yù)測SH3突變體與RIN1富含脯氨酸膜體的結(jié)合，根據(jù)P值大小判斷親和力。VMD1.8.7和PyMCL可視化圖形軟件分析不同的SH3突變體結(jié)構(gòu)，計(jì)算RMSd分析結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。設(shè)置對(duì)照：反義突變（結(jié)合力下降）和野生型（

6、未突變）。
　　2.構(gòu)建重組腺病毒載體表達(dá) SH3-m突變體（SH3-mutant）和野生型，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證突變體的作用，繼而篩選有效應(yīng)的高親和力突變體。免疫熒光法檢測突變體和野生型在 CML細(xì)胞中的定位；Western blot測定突變體的有效性。免疫共沉淀和質(zhì)譜技術(shù)分析SH3-m與RIN1的相互作用。選擇作用效果明顯的突變體進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　3.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析上述篩選出的SH3-m突變體聯(lián)合IM用藥，對(duì)KCL22和

7、K562細(xì)胞的效應(yīng)及 Bcr-Abl活性的影響和作用機(jī)制。MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分析細(xì)胞增殖情況；光鏡檢測細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、流式細(xì)胞術(shù)分析突變體對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；Western blot分析Bcr-Abl活性、底物磷酸化水平的變化以及 Bcr-Abl下游 PI3k/Akt、Ras/Raf/Mek/Erk1/2信號(hào)通路各指標(biāo)的變化；免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞骨架的重建情況。
　　獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1.用計(jì)算機(jī)分子模

8、擬技術(shù)（PepSite2.0軟件）分析出RIN1富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域與 Abl SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸是位于 Abl SH3 domain上疏水口袋周圍的含有苯環(huán)或類苯環(huán)的芳香族氨基酸（脯氨酸：Pro、色氨酸：Trp、天冬氨酰：Asn、酪氨酸：Tyr、苯丙氨酸：Phe），將這些氨基酸進(jìn)行一系列突變，P-value預(yù)算結(jié)合特異性，選擇結(jié)合能力高的三個(gè)突變體T79Y，N94W和T79YN94W（雙突變）和結(jié)合能力低的突變體：W99R及野

9、生型結(jié)構(gòu)，NAMD和VMD軟件成功演算穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。其中，低結(jié)合能力W99R及野生型為對(duì)照。
　　2.成功構(gòu)建六個(gè)重組腺病毒載體（包括不含目的片段的載體）：pAd-SH3、pAd-W99R、pAd-N94W、pAd-T79Y、pAd-T79YN94W和pAd-null（以下分別簡稱為：M0、M1、M2、M3、M4、T）。各種突變體能高效感染靶細(xì)胞并有不同的亞細(xì)胞定位：M0、M1、M3和T位于胞漿，M2和M4定位于胞漿和胞核。West

10、ern blot結(jié)果表明：與M0和T相比較，M1和M3抑制Bcr-Abl磷酸化蛋白的表達(dá)，抑制下游Stat5和Crkl磷酸化水平，而M2和M4作用與此相反。免疫共沉淀和質(zhì)譜檢測均證實(shí)M3、M4能與RIN1結(jié)合，M1不能與RIN1結(jié)合。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究高親和力M3的效應(yīng)及機(jī)制。
　　3.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，高親和力 M3突變體聯(lián)合 IM能顯著抑制KCL22和K562細(xì)胞生長，使細(xì)胞周期阻滯在S期，在IM中等耐藥細(xì)胞株KCL22中

11、效果優(yōu)于IM敏感株K562。形態(tài)學(xué)觀察到兩株細(xì)胞均出現(xiàn)核碎裂、空泡和核聚集的現(xiàn)象，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡；Western blot顯示能明顯抑制Bcr-Abl、Stat5和Crkl磷酸化水平，以及下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、c-Myc和周期蛋白 CyclinD1的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)。免疫熒光觀察到細(xì)胞骨架微絲或者微管蛋白出現(xiàn)明顯的聚集，且有邊緣化或者向中間聚集的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)：M1突變體雖未與RIN1結(jié)合，但聯(lián)合IM也能

12、顯著抑制KCL22和K562細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，本課題將計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)篩選出的高親和力 Abl SH3突變體M3聯(lián)合IM用藥，體外實(shí)驗(yàn)顯示能有效地抑制CML細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是阻滯了Bcr-Abl與RIN1的結(jié)合，從而抑制了Bcr-Abl活性及底物和磷酸化。本文的意義在于，通過對(duì)Abl SH3結(jié)構(gòu)及其與Bcr-Abl活性關(guān)系的深入研究，為CML治療方面特別是IM耐藥患者提供了分子靶點(diǎn)，同時(shí)也為臨床聯(lián)