亞洲棉NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析及相關(guān)NAC基因的克隆和功能研究.pdf

1、棉花（Gossypium）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，棉纖維是紡織工業(yè)的主要原料，棉花基因組序列圖譜的構(gòu)建為棉花的優(yōu)良品質(zhì)性狀、抗逆或抗病相關(guān)基因在整個(gè)基因組水平上的研究提供了重要資料，也為培育優(yōu)良品質(zhì)、抗逆或抗病的棉花新品種奠定了基礎(chǔ)。
　　轉(zhuǎn)錄因子是指那些具有真核啟動(dòng)子特定DNA序列結(jié)合活性的蛋白質(zhì)分子，或者是指那些具有已知DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)分子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在植物許多重要發(fā)育過(guò)程的調(diào)控網(wǎng)

2、絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。模式植物擬南芥中就有約5.9％的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛大量存在并發(fā)揮重要作用，使其成為后基因組研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。根據(jù)DNA結(jié)合域的不同，植物轉(zhuǎn)錄因子可分為很多家族，其中NAC((N)AM/(A)TAF/(C)UC)轉(zhuǎn)錄因子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)具有多種功能的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子。在植物體的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等許多生理過(guò)程中起著重要作用。目前，多種植物中的NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能已得到深入的闡述。
　　研

3、究發(fā)現(xiàn)，許多NAC轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥表皮細(xì)胞發(fā)育及莖次生壁形成中發(fā)揮重要的作用，由于棉花纖維細(xì)胞發(fā)育模式與擬南芥中纖維發(fā)育模式相似，因此為改善棉花纖維品質(zhì)研究，很多學(xué)者展開(kāi)了NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究，并取得了一定成果，但是，迄今為止，棉花NAC基因的相關(guān)研究主要集中在陸地棉中，二倍體棉花中NAC基因研究報(bào)道相對(duì)較少，尤其是亞洲棉NAC轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)研究還鮮有報(bào)道，并且全面而詳細(xì)的對(duì)棉花整個(gè)NAC家族的研究也極少。
　　本研究通過(guò)生物信息學(xué)

4、分析方法從亞洲棉蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并通過(guò)鑒定得到亞洲棉NAC轉(zhuǎn)錄因子基因家族的143個(gè)成員，然后對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)分析;研究了棉花NAC基因在亞洲棉、陸地棉和雷蒙德氏棉各組織器官中的表達(dá)模式以及分析了其可能的進(jìn)化關(guān)系，初步了解了棉花NAC轉(zhuǎn)錄因子潛在的重要功能。研究結(jié)果如下:
　　1.亞洲棉NAC家族基因的鑒定?；趤喼廾藁蚪M序列和亞洲棉29729條EST序列，并結(jié)合雷蒙德氏棉（Graimondii）NA

5、C轉(zhuǎn)錄因子家族的研究結(jié)果，利用生物信息學(xué)方法，鑒定出143個(gè)亞洲棉NAC基因。
　　2.亞洲棉NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析。根據(jù)NAC結(jié)構(gòu)域的序列對(duì)NAC蛋白的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)行分析，將亞洲棉NAC蛋白分為9個(gè)亞族。
　　3.基因重復(fù)在亞洲棉NAC基因家族的擴(kuò)增中發(fā)揮了重要作用?；蚪Y(jié)構(gòu)、基因染色體位置及在棉花基因組范圍內(nèi)對(duì)GaNAC基因進(jìn)行的同源性分析表明基因重復(fù)可能在亞洲棉NAC基因家族的擴(kuò)增和進(jìn)化中發(fā)揮了重要作用，最終導(dǎo)致了Ga

6、NAC基因在數(shù)量上、結(jié)構(gòu)上和功能上的多樣性。
　　4.NAC轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式分析及功能預(yù)測(cè)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)30個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子在陸地棉和亞洲棉不同器官和不同發(fā)育時(shí)期的纖維組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，鑒定出7個(gè)在亞洲棉纖維細(xì)胞次生壁加厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，進(jìn)一步明確了它們?cè)陉懙孛?、亞洲棉和雷蒙德氏棉三個(gè)棉種中的表達(dá)模式差異。初步預(yù)測(cè)了GaNAC基因在亞洲棉中的功能。
　　5.3個(gè)亞洲棉NAC基因的克隆。利用RT-PCR技術(shù)

7、克隆得到了3個(gè)NAC基因全長(zhǎng)cDNA，將其命名為GaNAC20、GaNAC09和GaNAC69，初步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GaNAC20和GaNAC09基因均含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，GaNAC69含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，為進(jìn)一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。
　　6.真核過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建。為進(jìn)一步研究GaNAC20、GaNAC09和GaNAC69基因的功能，我們將這3個(gè)基因分別與PBI121載體連接，置于35S強(qiáng)啟動(dòng)子下游構(gòu)建了真核過(guò)表