小麥磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaPHT21和TaPT2介導(dǎo)植株吸收利用磷素的生物學(xué)功能研究.pdf

1、植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PT)在介導(dǎo)植株對(duì)介質(zhì)中磷素(Pi)吸收以及植株體內(nèi)Pi在細(xì)胞、組織間跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要生物學(xué)功能。本項(xiàng)研究針對(duì)迄今小麥PT基因克隆、分子特征分析、生化特征鑒定和生物學(xué)功能研究較少的現(xiàn)狀，以作者所在試驗(yàn)室前期構(gòu)建的富集葉片豐磷基因和根系低磷基因的cDNA差減文庫(kù)為基礎(chǔ)，克隆了1個(gè)歸屬于PHT2家族的小麥PT基因TaPHT2;1和1個(gè)歸屬于PHT1家族的小麥PT基因TaPT2。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)上述基因的分子特征

2、及其對(duì)植株磷素營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控特性進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下。
　　1.TaPHT2;1與已報(bào)道部分植物種屬PHT2家族基因具有較高同源性，為PHT2家族成員。cDNA全長(zhǎng)為2094 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)1707 bp，編碼557個(gè)氨基酸。該基因編碼蛋白TaPHT2;1含有12個(gè)保守跨膜域，保守域7和保守域8之間具有1個(gè)較大親水區(qū)。
　　2.TaPHT2;1呈葉片優(yōu)勢(shì)表達(dá)特征，且受到低磷脅迫誘導(dǎo)，根系中該基因表達(dá)水平在豐、

3、缺磷條件下均明顯低于葉片。此外，該基因的表達(dá)還呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律特征，表現(xiàn)為進(jìn)入光期后，隨著光期進(jìn)程該基因的表達(dá)水平不斷增強(qiáng);進(jìn)入暗期后，該基因表達(dá)水平隨著暗期進(jìn)程不斷減弱。
　　3.用TaPHT2;1和綠色熒光蛋白基因(GFP)的融合基因轉(zhuǎn)化煙草和小麥，進(jìn)一步對(duì)融合蛋白在葉片亞細(xì)胞水平上的定位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該小麥PT定位在葉綠體被膜上，采用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，用TaPHT2;1的開(kāi)放閱讀框(ORF)遺傳轉(zhuǎn)化缺失高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)功能的酵

4、母突變體，證實(shí)該小麥PT基因具有補(bǔ)償突變體酵母Pi吸收的功能。上述結(jié)果表明，TaPHT2;1在介導(dǎo)胞質(zhì)和葉綠體間的Pi轉(zhuǎn)運(yùn)中可能發(fā)揮著重要功能。
　　4.在構(gòu)建反義表達(dá)TaPHT2;1雙元表達(dá)載體基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法遺傳轉(zhuǎn)化小麥幼胚外植體，建立了下調(diào)表達(dá)該小麥PT基因的轉(zhuǎn)基因系植株。對(duì)典型TaPHT2;1下調(diào)轉(zhuǎn)基因系（Line2和Line5）植株和野生型(WT)在豐磷（2 mmol/L Pi）和缺磷(100μmol/L Pi

5、)條件下的植株生長(zhǎng)特征、含磷量和光合參數(shù)研究表明，與WT相比，豐、缺磷條件下下調(diào)表達(dá)TaPHT2;1植株的葉綠體Pi濃度顯著下降，表明該小麥PT成員在調(diào)控胞質(zhì)中Pi向葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，與WT相比，供試豐、缺磷條件下下調(diào)表達(dá)TaPHT2;1轉(zhuǎn)基因株系的光合能力下降，植株全磷含量降低，單株磷累積量減少，植株長(zhǎng)勢(shì)變差。
　　5.研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)表達(dá)TaPHT2;轉(zhuǎn)基因植株豐、缺磷條件下的單株磷累積量均明顯低于WT，表明

6、該小麥PT基因不僅參與細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)與葉綠體間的Pi轉(zhuǎn)運(yùn)，而且也是植株體內(nèi)Pi信號(hào)通路的重要組分，參與對(duì)其他PT成員吸收介質(zhì)中Pi及轉(zhuǎn)運(yùn)組織間Pi的調(diào)控。
　　6.TaPT2與部分植物種屬PHT1家族成員高度同源，為小麥PHT1家族基因。該基因的全長(zhǎng)cDNA為1802 bp，編碼多肽鏈的氨基酸殘基數(shù)量為525個(gè)，編碼蛋白的分子量為57.5 kDa，等電點(diǎn)為8.65?？缒び蝾A(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，TaPT2含有12個(gè)保守跨膜域，該翻譯蛋白經(jīng)內(nèi)

7、質(zhì)網(wǎng)分選后靶向細(xì)胞質(zhì)膜。
　　7.采用PCR技術(shù)擴(kuò)增了TaPT2的編碼閱讀框序列，利用DNA重組技術(shù)將其融合至酵母表達(dá)載體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化缺失高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酵母突變體MB192。結(jié)果表明，TaPT2具有補(bǔ)償MB192在低磷脅迫下Pi吸收的功能。
　　8.TaPT2的表達(dá)呈典型的根系優(yōu)勢(shì)表達(dá)且表達(dá)水平受到低磷脅迫的明顯誘導(dǎo)。采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了將TaPT2開(kāi)放閱讀框分別以正義和反義方式融合至表達(dá)載體的表達(dá)框，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)

8、的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)建立上、下調(diào)表達(dá)TaPT2的轉(zhuǎn)基因植株。
　　9.以野生型植株和典型上、下調(diào)表達(dá)TaPT2的轉(zhuǎn)基因株系植株為材料，通過(guò)設(shè)置豐、缺磷處理水培試驗(yàn)，研究了遺傳轉(zhuǎn)化TaPT2對(duì)植株抵御低磷逆境的影響。結(jié)果表明，豐磷條件下，與WT相比，上、下調(diào)表達(dá)TaPT2轉(zhuǎn)基因株系植株的單株干重、全磷含量、單株磷累積量和葉片光合參數(shù)沒(méi)有改變;低磷脅迫下，與WT相比，下調(diào)表達(dá)TaPT2轉(zhuǎn)基因植株的單株干重、全磷含量、單株磷累積量和葉片光合能

9、力下降，而上調(diào)表達(dá)TaPT2的轉(zhuǎn)基因植株的單株干重、全磷含量、單株磷累積量和葉片光合能力則較WT顯著增高。表明，TaPT2是一個(gè)高親和PTH1家族成員，在調(diào)控低磷下植株磷素的吸收具有重要功能。
　　10.本研究表明，TaPHT2;1和TaPT2分別是小麥PHT2和PHT1家族成員，分別在介導(dǎo)葉片細(xì)胞胞質(zhì)中Pi向葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)和介導(dǎo)植株對(duì)低磷逆境下Pi吸收中發(fā)揮著重要生物學(xué)功能。上述基因在小麥資源和種質(zhì)的磷效率評(píng)價(jià)和新型磷高效種質(zhì)（品種