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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是累及關(guān)節(jié)的慢性自身免疫性疾病,其病理特征主要是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與滑膜細(xì)胞增生,嚴(yán)重影響人們的健康狀態(tài)和生活質(zhì)量。迄今為止,RA的病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與感染和細(xì)胞免疫狀態(tài)相關(guān)。HMGB1是高遷移率族蛋白超家族的成員之一,是一種富含非組蛋白的核蛋白。分泌到細(xì)胞外的HMGB1被認(rèn)為是一種重要的炎癥細(xì)胞因子。近年的研究表明,HMGB1也參與自身免
2、疫性疾病,如RA、SLE等。Th17作為新發(fā)現(xiàn)的炎癥性細(xì)胞,主要參與炎癥和自身免疫性疾病。我們前期的研究表明,在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者,存在著Th17細(xì)胞上調(diào)和HMGB1優(yōu)勢(shì)表達(dá)的微環(huán)境狀態(tài),且表明其與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。本研究旨在進(jìn)一步探討HMGB1對(duì)Th17等免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)路徑和相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑,研究他們之間的相互關(guān)系及其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制,為尋找類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的新途徑奠定基礎(chǔ)。
目的:
3、> 建立自制雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型,分析TLR在關(guān)節(jié)炎小鼠PBMC和RAW264.7細(xì)胞系的分布及其血清相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化;進(jìn)一步在檢測(cè)臨床類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血相關(guān)細(xì)胞因子的變化和單核細(xì)胞TLR2、IL-17表達(dá)水平的基礎(chǔ)上,探討TLR2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者單核細(xì)胞表達(dá)與Th細(xì)胞水平變化的關(guān)系及其參類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的免疫機(jī)制。
方法:
1.小鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的建立:將CFA與CⅡ溶液
4、1:1混合于研缽中,CⅡ終濃度為1mg/mL,置于冰盒上繼續(xù)研磨到油包水狀態(tài)。然后吸入一次性注射器中,固定好DBA/1小鼠,于尾根部1cm處皮下注射,每只為100μL。于第21天進(jìn)行再次免疫,將IFA與CⅡ溶液1:1混合于研缽中,同樣于尾根部約1cm處皮下注射,每只約100μL,盡量避免與初次注射相同位置。于第二次免疫后每天觀察小鼠的發(fā)病情況,進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄小鼠發(fā)病時(shí)間,并測(cè)量小鼠發(fā)病時(shí)腳趾的厚度,觀察炎癥情況評(píng)價(jià)炎癥得分等。炎癥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
5、:根據(jù)小鼠踝關(guān)節(jié)、跖趾關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)紅腫程度和受影響關(guān)節(jié)數(shù)進(jìn)行評(píng)分。0分:正常;1分:1個(gè)關(guān)節(jié)的紅腫;2分:2個(gè)及2個(gè)以上關(guān)節(jié)的紅腫;3分:波及全足的嚴(yán)重紅腫;4分:嚴(yán)重紅腫且不能負(fù)重。四肢分別進(jìn)行評(píng)分,累計(jì)總和為炎癥得分。
2.熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞或單核細(xì)胞IL-17、IL-6、IL-23、TGF-β以及TLR2等mRNA表達(dá)水平:應(yīng)用TRIzol分離細(xì)胞總RNA、無RNA酶雙蒸水洗脫,進(jìn)行逆
6、轉(zhuǎn)錄PCR。熒光定量PCR擴(kuò)增并分析相關(guān)細(xì)胞因子和TLR2等mRNA的表達(dá)水平,簡(jiǎn)言之,應(yīng)用7500快速Real-Time PCR擴(kuò)增儀,于總反應(yīng)體積20μl(5μlSYBR Green1,0.4μl引物,0.06μlTagDNA多聚酶,2.5μlddH2O和2μlcDNA)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。通過Tm值分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,樣本中目的基因的拷貝數(shù)應(yīng)用Biosystem軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。
3.免疫組化染色分析IL-17分
7、泌細(xì)胞:應(yīng)用免疫組化染色的方法檢測(cè)浸入CIA小鼠模型病變局部的IL-17分泌細(xì)胞(Th17細(xì)胞)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例,以及體外HMGB1刺激后Th17細(xì)胞的變化,探討此類細(xì)胞在CIA和RA發(fā)生發(fā)展過程中的變化和HMGB1在其中發(fā)揮的作用。
4.流式細(xì)胞儀分析TLR2的表達(dá)和分選CD14陽(yáng)性單核細(xì)胞:檢測(cè)細(xì)胞表面膜分子,以確定外周血單核細(xì)胞及其TLR2表達(dá)水平。外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液與T
8、LR2單克隆抗體共育,細(xì)胞洗后在與FITC標(biāo)記的抗CD14單克隆抗體共育,洗滌后重新懸浮于含1%FCS/PBS溶液,流式細(xì)胞儀上樣分析和分選。
5.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析細(xì)胞因子濃度:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血漿中IL-6、IL-23、IL-17等細(xì)胞因子濃度和體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌水平,應(yīng)用ELISA間接法進(jìn)行檢測(cè)。
6.Westernblot分析單核細(xì)胞NF-KB的表達(dá)水平:?jiǎn)魏思?xì)胞溶解后于12%SDS-PAG
9、E電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜置于5%去脂奶Tween20磷酸緩沖鹽水中,室溫放置1小時(shí),酶標(biāo)記的抗NF-kB抗體4℃反應(yīng)過夜,發(fā)光儀檢測(cè)并作圖像分析。
結(jié)果:
1.應(yīng)用自制的雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)Balb/c小鼠,成功建立了雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型,小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率為100%,平均發(fā)病時(shí)間為354±5天,關(guān)節(jié)炎癥得分為10±2分。
2.體外試驗(yàn)表明,巨噬細(xì)胞系(RAW)表面可表達(dá)TLR2、TLR4、TL
10、R5、TLR7、TLR8和TLR9等。在CIA造模成功的基礎(chǔ)上,研究發(fā)現(xiàn)模型鼠Th17細(xì)胞的浸潤(rùn)可見于CⅡ免疫接種45天后。CⅡ刺激的腹腔巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)量增加。此外,腹腔巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR8、TLR9等mRNA表達(dá)水平在模型鼠呈現(xiàn)明顯的增加,且血清IL-6、IL-17、TGF-β、IL-1β含量也明顯升高。經(jīng)抗TLR2抗體封蔽后,上述TLR的表達(dá)和細(xì)胞因子的表達(dá)量則明顯降低。
3.流式細(xì)胞儀分析表明,在
11、RA患者,其外周血中CD14+單核細(xì)胞比例明顯增加,且單核細(xì)胞表面的TLR2表達(dá)也增加,與健康對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.001)。此外,RA患者血清IL-17、IL-23、HMGB1等細(xì)胞因子水平和單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-6、IL-23和TGF-β蛋白含量均有明顯增加。
4.體外HMGB1刺激可增強(qiáng)單核細(xì)胞TLR2的表達(dá)水平和IL-23、IL-17、IL-6等細(xì)胞因子的分泌水平,與無HMGB1體外刺激的單核細(xì)胞相比有顯著
12、性差異;這種HMGB1刺激TLR2、IL-23、IL-17和IL-6表達(dá)上調(diào)的效應(yīng),在來源于RA外周血的CD14陽(yáng)性單核細(xì)胞則表現(xiàn)得更加明顯,與健康對(duì)照組來源的單核細(xì)胞相比有顯著性差異(p<0.001)。
5.免疫組化分析表明,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中分泌IL-17的細(xì)胞比例明顯增加,尤以HMGB1刺激后為著。
6.Western blot分析結(jié)果顯示,與HMGB1共育的RA患者外周血單核細(xì)胞的NF-κB
13、表達(dá)明顯增加。
結(jié)論:
1.CIA小鼠模型和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究均表明,在疾病發(fā)生發(fā)展過程中HMGB1、Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子均明顯上調(diào),且同時(shí)伴有IL-1β、IL-6、IL-17和TGF-β表達(dá)的增強(qiáng),表明HMGB1和Th17細(xì)胞均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和病程相關(guān)。那么同處于共同微環(huán)境的HMGB1和Th17細(xì)胞的關(guān)系如何?啟發(fā)了我們進(jìn)一步深入研究的思路。
2.在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者,外周血CD14陽(yáng)性的單
14、核細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)水平升高。且體外HMGB1可有效刺激單核細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)水平,同時(shí)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例增加??筎LR2單克隆抗體可阻斷HMGB1的這種刺激作用。當(dāng)抗TLR2抗體應(yīng)用后,HMGB1刺激上調(diào)單核細(xì)胞TLR2的表達(dá)和分泌IL-1β、IL-6、IL-17的促進(jìn)作用同樣受到抑制。首次表明HMGB1可能是通過TLR2途徑促進(jìn)炎癥時(shí)Th17細(xì)胞的上調(diào)。
3.HMGB1對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)
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